NK細(xì)胞活化擴(kuò)增培養(yǎng)

自然殺傷細(xì)胞（NK）是重要的免疫細(xì)胞，能識(shí)別并清除腫瘤和病毒感染。體外大量培養(yǎng)NK細(xì)胞，滿足免疫治療所需一向比較困難。據(jù)資料，現(xiàn)有的培養(yǎng)方法都是采用擴(kuò)增培養(yǎng)基搭配細(xì)胞因子（IL-2，IL-7，IL-15）的方案，需要研究者自行優(yōu)化后使用。

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Corning的NK培養(yǎng)套裝包含抗體預(yù)包被T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，50mL NK細(xì)胞活化培養(yǎng)基，1.8mL NK細(xì)胞活化添加劑和1 L NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基。前三個(gè)組份特別設(shè)計(jì)用于NK細(xì)胞活化，而NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基用于NK細(xì)胞擴(kuò)增。NK活化培養(yǎng)基和擴(kuò)增培養(yǎng)基生產(chǎn)都是使用高質(zhì)量試劑和cGMP級(jí)的原料。培養(yǎng)基唯二所含蛋白是注射級(jí)的血清白蛋白和重組人胰島素。

Corning? NK Expansion Kit組成

NK細(xì)胞活化培養(yǎng)基

NK細(xì)胞活化添加劑

NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基

抗體預(yù)包被T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶

細(xì)胞培養(yǎng)袋

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Corning? NK Expansion Kit特色

擴(kuò)增能力強(qiáng)，在14天內(nèi)可達(dá)到100倍擴(kuò)增

效應(yīng)細(xì)胞比例高，可達(dá)80％

?操作方便

Corning? NK細(xì)胞活化擴(kuò)增培養(yǎng)套裝性能

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—接種容器 預(yù)包被T-75培養(yǎng)瓶

—組份

Pre-coated T-75 flask?抗體預(yù)包被T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶

50 mL NK細(xì)胞活化培養(yǎng)基

1.8 mL NK細(xì)胞活化添加劑

1L ?NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基

—操作友好度 方法明確，操作簡(jiǎn)單

—抗凝劑兼容性 肝素，檸檬酸鈉

—細(xì)胞產(chǎn)量（14天，30mL?血樣） 約?3?萬(wàn)億

—擴(kuò)增倍數(shù) 約100倍

—CD3-CD56+表型，14天 83%

—NK效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量 約2.5萬(wàn)億

—細(xì)胞殺傷力（ET=5:1，靶細(xì)胞K562） 77.9%

—培養(yǎng)體積 1.5L

—培養(yǎng)周期 14天

NK?細(xì)胞擴(kuò)增和活化方法

1.??抗凝血室溫離心，400 xg，10min，上層血漿轉(zhuǎn)移到新管。

2.??熱滅活自體血漿，56°C，30min。離心，?800 xg?，?20 min，去除沉淀。4°C?保存上清血漿，培養(yǎng)備用。

3.??加入等體積PBS（不含鈣鎂）替代被移除血漿保持體積不變，小心重懸血細(xì)胞。

注意：PBS預(yù)加0.1%人血清白蛋白（HSA）利于保持血細(xì)胞活性。

4.??使用淋巴細(xì)胞分離液從上面的血樣中制備PBMCs（人外周血單個(gè)核細(xì)胞）。

注意：使用新鮮采集的人血（2h內(nèi)采集）有利培養(yǎng)，不要使用超過(guò)24h的血樣。

5.??至少5倍體積的PBS（不含鈣鎂）清洗PBMCs。室溫離心500xg，10min，收集PBMCs。

6.???PBMCs稀釋到?1 x 10⁶?cells/mL，使用NK活化培養(yǎng)基配比1.8mL NK活化添加劑和10%自體血漿。

7.??預(yù)包被T-75培養(yǎng)瓶使用前，用PBS（不含鈣鎂）清洗兩次。

8.??添加30 mL PBMC懸液到預(yù)包被T-75培養(yǎng)瓶，37°C，5%?CO2培養(yǎng)。

注意：第六天之前，如果培養(yǎng)基變黃，細(xì)胞密度超過(guò)2.0 x 10⁶?cells/mL，需要添加新鮮的NK活化培養(yǎng)基配比10%自體血漿，保持細(xì)胞密度大于?5 x 10^5?cells/mL。

9.??培養(yǎng)第六天，培養(yǎng)液離心，適量NK擴(kuò)增培養(yǎng)基（1000 IU/mL IL-2?和10%自體血漿）重懸細(xì)胞，再轉(zhuǎn)移到T-225培養(yǎng)瓶或透氣細(xì)胞培養(yǎng)袋。

10.??每隔兩三天，根據(jù)細(xì)胞擴(kuò)增狀態(tài)，培養(yǎng)體系中添加新鮮的NK擴(kuò)增培養(yǎng)基（1000 IU/mL IL-2?和10%自體血漿）保持細(xì)胞密度在5 x 10⁵到?2.0 x 10⁶?cells/mL之間。

注意：NK擴(kuò)增階段，所加新鮮培養(yǎng)基自體血漿含量推薦范圍：0.5%-1%。

11.??培養(yǎng)14天左右，收獲NK細(xì)胞。

注意：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，細(xì)胞懸液吹打和培養(yǎng)容器拍打都要輕柔，以避免細(xì)胞損傷，保持細(xì)胞活性。

Corning? NK Expansion Kit

Natural killer (NK) cells are crucial immune cells that can recognize and kill tumors and virus infection. It is difficult to obtain the large numbers of NK cells ex vivo that are necessary for adoptive immunotherapy. Several methods of NK activation/expansion have been reported that use expansion medium plus various cytokines (e.g., IL-2, IL-7, and IL-15). However, these require further optimization by researchers.

The Corning NK kit contains a pre-coated T-75 flask, 50 mL NK Primary medium, 1.8 mL NK Primary supplement, and 1L NK Expansion medium. The first three components are specially designed for NK cell activation, whereas the NK Expansion medium is utilized for NK cell expansion. Both NK Primary medium and NK Expansion medium are manufactured using high quality reagents and cGMP-grade raw materials. The only proteins present in the media are injectable levels of serum albumin and recombinant human insulin.

Corning? NK Expansion Kit?自然殺傷細(xì)胞活化擴(kuò)增培養(yǎng)套裝?performance

Seeding vessels Pre-coated T-75 flask

Components Pre-coated T-75 flask;

50 mL NK Primary medium

+ 1.8 mL primary supplements; 1L NK Expansion medium; permeable cell culture bag.

Operator friendliness Easy operation with clear protocol

Anticoagulant compatibility Heparin, sodium citrate

Cell yields (14 days, 30 mL blood samples) ~3 billion

Expansion fold ~100-fold

Phenotype (CD3-CD56+) NK cell (Day 14) 83%

Number of effective NK cells ~2.5 billion

Cytotoxicity (ET = 5:1, target cell: K562) 77.9%

Media volume 1.5L

Period 14 days