Takara Bio Europe AB Cellartis人源肝臟細胞及iPS向肝臟細胞定向分化相關產(chǎn)品
Takara旗下Cellartis品牌致力于整個干細胞研究用產(chǎn)品的研發(fā)、探索、優(yōu)化、創(chuàng)新，力爭為干細胞研究者提供基礎研究和應用的全套系列產(chǎn)品。Cellartis 目前擁有多款iPS細胞分化而來的組織細胞產(chǎn)品，包括胰腺β細胞、肝臟細胞、心肌細胞，方便您進行藥物篩選、疾病研究以及再生醫(yī)學研究，同樣也可以作為iPS細胞定向分化為組織細胞的陽性對照。
5月21日，法國生物公司Cellectis集團下的Cellectis干細胞部宣布推出來源于人誘導多能干細胞（iPS）的肝細胞產(chǎn)品，即hiPS-HEP。
hiPS-HEP具同質性、再生性及生命周期長且CYP活性穩(wěn)定的特點，能夠為藥物發(fā)現(xiàn)、毒性試驗與疫苗研發(fā)等一系列體外研究提供理想的平臺。
Cellectis干細胞部首席科學家（CSO）Johan Hyllner表示，各醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)間的的高度相關性會使hiPS-HEP成為頗具前景的研發(fā)系統(tǒng)。
“制藥企業(yè)迫切需要應用于藥物研制早期更佳的、與臨床相關性更高的模型，以評價肝毒性、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點及研發(fā)新疫苗，”Hyllner 補充道:hiPS-HEP來源于人誘導多能干細胞（iPS），嚴格依照質量控制和倫理批準程序。
【產(chǎn)品簡介】
Takara Bio Europe AB Cellartis的hiPS-HEP是人肝細胞來源的誘導多能性干細胞細胞系。細胞分化為肝細胞樣細胞，游離于細胞內(nèi)懸浮液，并凍結在小瓶。Cellartis hiPS-HEP細胞有涂層基體維護介質補充。
hiPS-HEP具同質性、再生性及生命周期長且CYP活性穩(wěn)定的特點，能夠為藥物發(fā)現(xiàn)、毒性試驗與疫苗研發(fā)等一系列體外研究提供理想的平臺。
由干細胞分化而來的組織細胞被認為是新型藥物開發(fā)篩選的理想模型，具有廣闊的應用前景。因為干細胞分化而來的組織細胞可以在體外模擬機體細胞對高新藥物的毒性與效應，而且干細胞可以在體外無限增殖和分化為多種細胞類型，避免了從個體原代細胞作為材料，取材復雜、難度大、材料批間差大、無法長期穩(wěn)定供應等缺點。
iPS向肝臟細胞定向分化操作系統(tǒng)
(Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System)
以肝臟細胞為模型的實驗越來越受到重視，在肝臟病變機理研究、藥物代謝研究、藥物毒理評估等方面有廣闊的應用前景。然而，以個體原代肝細胞為材料來源會產(chǎn)生如取材困難、材料批間差大、無法長期穩(wěn)定供應等一系列難以克服的問題。因此，通過iPS批量轉化生產(chǎn)肝細胞的方法就顯示出特別的優(yōu)勢。Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System可以穩(wěn)定地、規(guī)?；貙崿F(xiàn)iPS向hepatocyte的誘導轉化生產(chǎn)，而且誘導轉化出的肝細胞能夠穩(wěn)定表達藥物代謝相關酶系統(tǒng)和藥物轉運系統(tǒng)。
Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System是一套Do-It-Yourself系統(tǒng)，客戶既可以對某個特殊病人來源的iPS實現(xiàn)轉化，也可以利用cellartis供應的iPS進行標準化操作。使用本產(chǎn)品的過程起始于誘導人iPS轉化成為確定性內(nèi)胚層（Definitive Endoderm (DE)）細胞，然后誘導轉化DE至肝細胞。本產(chǎn)品是All-In-One型產(chǎn)品，實驗所需的培養(yǎng)基、基質（coating）等包括在內(nèi)。應用本產(chǎn)品轉化約3 × 106 hiPS cells,可以獲得約5 × 106 肝細胞（大約50 cm2面積的單層貼壁細胞）。
關于Cellartis 卓越的iPS Cell to Hepatocyte Differentiation技術的專項說明，歡迎來電咨詢。
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【產(chǎn)品參數(shù)】
Cellartis肝細胞培養(yǎng)基 Y30051
Cellartis肝細胞分化試劑盒 Y30050
Y30050包裝組成：1瓶肝細胞解凍培養(yǎng)基 25ml
1瓶肝細胞干細胞培養(yǎng)基 50ml
2瓶肝細胞成熟培養(yǎng)基 24ml
1瓶肝細胞成熟培養(yǎng)基補充基質 2.6ml
3瓶肝細胞維持培養(yǎng)基 50ml
1管肝細胞膜 7.5ml
Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng) Y30020

包裝1:
· 100 ml DEF-CS 100 培養(yǎng)基
· 800 μl DEF-CS COAT-1
包裝 2:
· 300 μl DEF-CS GF-1
· 100 μl DEF-CS GF-2
· 40 μl DEF-CS GF-3

Cellartis定型內(nèi)胚層分化試劑盒 Y30030
包裝組成：10 ml 定形內(nèi)胚層分化涂層?
18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 0
18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 1
18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 2
25 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 3
47 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 4
47 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 6
Cellartis定形內(nèi)胚層分化試劑盒def-cs Y30035
【產(chǎn)品應用】
近年來，人源肝細胞的需求日益增多。新藥的開發(fā)與應用、病毒性肝炎的實驗研究、肝細胞移植及生物人工肝的研究應用等等均需要大量的人源肝細胞。但人肝細胞來源困難，細胞分離、培養(yǎng)及儲存的技術尚不完善，體外培養(yǎng)存活時間短，其供給無法滿足日益增多的需求。近幾年永生化的人肝細胞技術進展較快。人肝細胞在體內(nèi)有極強的增殖能力，而在體外培養(yǎng)時增殖困難。利用Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System轉化得到的肝細胞除了清晰表現(xiàn)出肝細胞的必備特征外（如肝細胞特異性標志物、CYP系列酶等），還保留了原始細胞供體者的遺傳基因背景。另外，相比較從組織切除獲得的原代肝臟細胞（通常需要低溫保存），通過本產(chǎn)品系統(tǒng)轉化獲得的肝細胞在更長的時間跨度上保持著生理功能的穩(wěn)定性。這一點對于毒理學評估和病毒感染評估具有顯著的意義。為長時間維持培養(yǎng)hiPS轉化而來的肝細胞，我們推薦Cellartis?肝細胞培養(yǎng)基 Cellartis Hepatocyte Maintenance Medium (Cat. No. Y30051)。
【產(chǎn)品特點】
·高重復性，強大的系統(tǒng)——通過作用于25個不同的iPS細胞得到相同高精確度的科研報告，沒有必要線性優(yōu)化
·藥物代謝和安全研究的理想細胞——生成>90%高純度、具有功能性的iPS細胞
·自定義起始材料開始與任何疾病相關的iPS細胞系，創(chuàng)造準確的肝臟疾病模型
·擴展的實驗窗口肝細胞可用于至少11天的功能測試
【Cellartis肝細胞培養(yǎng)基操作】
1.解凍hiPS-HEP
一瓶cellartis hiPS-HEP 包含≥1.23 x 107活細胞。建議細胞是懸浮在15ml的培養(yǎng)基和鍍在密度為4×105活細胞/平方厘米（一個150μL /96孔板或1000μL / 24孔板等）。要計算活細胞的數(shù)目，然而，不建議使用超過15ml的電鍍介質/小瓶。
剛解凍的cellartis hiPS-HEP細胞是很脆弱的。不要用吸管混合細胞懸液。播種時只使用吸管。

A.制備
·用Cellartis HEP Coat將Cellartis肝細胞培養(yǎng)基覆蓋
·準備和加熱適當?shù)慕鈨鼋橘|和電鍍介質37°C ± 1°C
B.解凍細胞
1.將小瓶直接從液氮中轉移至37°C± 1°C水浴。
2.細胞懸浮液應該解凍，直到有可能把它從小瓶，包括任何冷凍部件。
3.約1分鐘后，檢查細胞懸浮液是否充分解凍仔細把瓶子顛倒過來。凈化的外表面用適當?shù)南緞⑿∑糠湃肷锇踩瘛?br /> 4.解凍后，將細胞懸液倒入19ml,37°C ± 1°C解凍培養(yǎng)基中。洗瓶以1ml,37°C ± 1°C解凍培養(yǎng)基加入解凍培養(yǎng)基中。
5.小心地將包含細胞懸浮液的封閉管反轉約10次。
6.將細胞懸液中室溫解凍15–20分鐘。潛伏期較長可能會對細胞活力產(chǎn)生負面影響。
7.可選：計數(shù)活細胞用血細胞計數(shù)器。Aliquot 50μl細胞懸液，加入5μl臺盼藍染色，計數(shù)活細胞，活細胞數(shù)，乘以1.1得到活細胞濃度。細胞懸浮液含有單細胞和小細胞團確保計數(shù)的活細胞。
8.離心機在100 x在RT為2分鐘，
9.用吸管移走解凍介質，不干擾細胞顆粒。松開電池小球彈管和懸浮細胞顆粒非常小心地慢慢加入15ml 37°C ± 1°C電鍍介質。不建議使用超過15毫升電鍍介質/小瓶。
10.拆下cellartis Hep外套從細胞培養(yǎng)威爾斯之前播種的細胞。
11.仔細的種子細胞，為包覆細胞培養(yǎng)單元，采用150μL / 96孔板或1000μL / 24孔板。
【多瓶解凍】
幾個小瓶可以在同一時間解凍：
·根據(jù)小瓶的數(shù)量（如80ml）增加解凍培養(yǎng)基的體積（4ml/瓶）。倒入解凍細胞懸浮液
·在50ml離心管中分配細胞懸液，每管加入不超過40ml。
·加鍍介質按瓶數(shù)（例如，30ml的兩瓶）和同樣將細胞懸液分配到離心管中。
·細胞懸液可以匯集來自不同管播種前結合成一瓶或一管
【Cellartis肝細胞培養(yǎng)基的維護】
建議手動移液用于介質的變化而不是真空泵（使用多通道吸管96孔板）。為了確保細胞不離開沒有更長的培養(yǎng)基超過幾秒鐘，改變介質只在四到八wells/time。
A.DAY 1
洗hepatocytes兩次（基地維修中）和改變介質（Cellartis Enhanced hiPS-HEP Maintenance Medium，0.5ml/cm2）
1.制備
·準備和預熱適量的基礎保養(yǎng)介質至37°C ±1°C
·準備和預熱完整的培養(yǎng)基
2.介質改變
·兩次輕輕洗細胞預熱養(yǎng)護基（0.5ml/cm2）刪除獨立細胞。不要使用真空泵，而是手動吸管。（使用96孔板的多通道吸管）
·洗滌步驟后，小心地將其放入預熱的Cellartis肝細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板（0.5ml/cm2）。
·把cellartis肝細胞培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)板放在一個孵化器（37°C±1°C，5% CO 2，和≥濕度90%)。
·丟棄剩余的預熱Cellartis肝細胞培養(yǎng)基
DAY 3
介質應改為2到3次/天。如果離開cellartis肝細胞培養(yǎng)基沒有變化超過一周，星期五增加50%的介質（即，1.5毫升/井一個24板和230μL / 96孔板等）。最好在星期五晚些時候或星期一初改變介質。
1.制備
解凍cellartis肝細胞培養(yǎng)基
2.介質改變
·輕輕地去除約90%的cellartis肝細胞培養(yǎng)基從細胞培養(yǎng)板維修中丟棄（即最大150μL/96孔板0。不要使用真空泵，而是手動。（使用96孔板的多通道吸管)
·很小心地將預熱的cellartis肝細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板，使用0.47毫升/厘米2（即150μL的每一個96孔板，每孔0.94毫升/24孔的細胞培養(yǎng)板，使用0.47毫升/厘米2（即150μL的每一個96孔板，每孔0.94毫升/24孔）
·把cellartis肝細胞培養(yǎng)基在37°C±1°C，5% CO 2，和≥濕度90%。
·丟棄剩余的cellartis肝細胞培養(yǎng)基
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【產(chǎn)品實驗圖】

肝細胞分化的免疫細胞化學分析：利用cellartis iPS細胞向肝細胞分化的系統(tǒng)，hips細胞分化為功能性肝細胞。肝細胞進行免疫組化染色檢測早期肝細胞標志物14日HNF4α（紅核）和21日CK18（綠色）。由于肝細胞成熟，28天，肝臟特異性標記的CYP3A表達（紅色，胞漿）和Albumin（綠色）增加。與預期一樣，細胞的細胞核用DAPI染色（藍色）。
【Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng) Y30020】
Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)是一個完整的有效的擴張和規(guī)模的培養(yǎng)系統(tǒng)，在無飼養(yǎng)者和定義環(huán)境中的誘導多能干細胞。
圖1解凍、維持（介質變化和通道）和人類的冷凍保存示意圖
iPS細胞在Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)線路如圖1所示。細胞增殖能力500ml的Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)：20x T25或8x T75或4x T150/燒瓶

人類iPS細胞系，保持Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)應該三到四次/天傳代，每日介質變化。當細胞密度稀疏時，你可以每隔一天更換一次介質；然而，重要的是改變媒介后的一天，通過或解凍，以及前一天通過或冰凍的.建議細胞生長到最大的匯合點1.5 – 3 x 105細胞/平方厘米。每周進度表見表。

未分化的人iPS細胞保持在其他培養(yǎng)系統(tǒng)可以很容易地轉移，到Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)。新鮮的培養(yǎng)基可以在傳代和冷凍培養(yǎng)，解凍后直接使用Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)。它需要2至5通道來適應。
當最初將iPS細胞轉移到這個系統(tǒng)時，一些細胞特性可能與以前使用的培養(yǎng)系統(tǒng)不同。首先，該Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)利用單細胞傳代，并因此，在Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細胞的形態(tài)不同的細胞在使用聚合系統(tǒng)培養(yǎng)傳代方法。其次，新的傳代細胞容易擴散出。然而，增殖時，細胞密度更高，典型的未分化干細胞形態(tài)（即高核質比，定義的邊界，突出核仁）出現(xiàn)。
【故障排除】
1、細胞不分離在通道
太冷tryple選擇酶。確保tryple選擇酶使用前回火。傳代時傳代細胞密度不太低。細胞通常更容易分離在較高密度。傳代時細胞密度推薦播種密度通道間隔不是最優(yōu)的，對于所使用的細胞系。播種密度和通道間隔需要優(yōu)化。細胞分化似乎細胞已被播種太稀疏。確保播種密度是至少4×104細胞/平方厘米，一些
細胞株可能需要更高的播種量密度。。
2、轉移細胞不適應cellartis def-cs培養(yǎng)系統(tǒng)細胞不適用于新的環(huán)境。
細胞可能受益于更高對cellartis def-cs濃度coat-1。使用1:10的稀釋或1:5在前幾段提供額外的支持適應的過程。新轉移的細胞可能最初以稍慢的速度增長。延長通道間隔長達7天。
3、細胞不粘附在通道或解凍def-cs coat-1被攤薄。
在杜貝爾科磷酸鹽緩沖鹽水–/–。確保使用杜貝爾科磷酸鹽緩沖鹽水與Mg2+
和Ca2+。延長培養(yǎng)時間def-cs coat-1。
4、細胞稀疏，即使在七天中培養(yǎng)通道上附著的細胞太少。
增加播種密度。即使在七天中文化所使用的細胞增加GF-1體積增長速度緩慢，使用最大1:111稀釋。

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