以肝臟細(xì)胞為模型的實(shí)驗(yàn)越來(lái)越受到重視，在肝臟病變機(jī)理研究、藥物代謝研究、藥物毒理評(píng)估等方面有廣闊的應(yīng)用前景。然而，以個(gè)體原代肝細(xì)胞為材料來(lái)源會(huì)產(chǎn)生如取材困難、材料批間差大、無(wú)法長(zhǎng)期穩(wěn)定供應(yīng)等一系列難以克服的問(wèn)題。因此，通過(guò)iPS批量轉(zhuǎn)化生產(chǎn)肝細(xì)胞的方法就顯示出特別的優(yōu)勢(shì)。Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System可以穩(wěn)定地、規(guī)?；貙?shí)現(xiàn)iPS向hepatocyte的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，而且誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化出的肝細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)藥物代謝相關(guān)酶系統(tǒng)和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。

人類iPS細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的簡(jiǎn)單而通用的系統(tǒng)
Cellartis細(xì)胞iPS向肝細(xì)胞分化系統(tǒng)是一個(gè)完整的系統(tǒng)，包括所有培養(yǎng)基、補(bǔ)充劑和將任何iPS細(xì)胞系分化為肝細(xì)胞的方案(Laydon, Bangham, and Asquith 2015)。該方案模擬體內(nèi)肝臟發(fā)育:iPS細(xì)胞首先分化為最終內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞，然后進(jìn)一步分化為成熟肝細(xì)胞。分化成熟肝細(xì)胞在分化第21天準(zhǔn)備好用于您的研究應(yīng)用，并且具有至少11天的實(shí)驗(yàn)時(shí)間窗口。

iPS細(xì)胞到肝細(xì)胞分化系統(tǒng)概述。完整的系統(tǒng)包括培養(yǎng)基、補(bǔ)充物和將任何iPS細(xì)胞系分化為肝細(xì)胞的方案。

培養(yǎng)效果：

從hiPS細(xì)胞系中衍生同質(zhì)終代內(nèi)胚層細(xì)胞。A. RT-qPCR分析顯示，DE細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4 (A1)和NANOG (A2)的表達(dá)下調(diào)。與未分化的hiPS細(xì)胞相比，DE細(xì)胞中DE標(biāo)記物CXCR4 (A3)和SOX17 (A4)的mRNA表達(dá)強(qiáng)烈上調(diào)。胚胎外標(biāo)記物SOX7 (A5)的低表達(dá)表明胚胎外內(nèi)胚層細(xì)胞極少發(fā)生。b組DE標(biāo)記物SOX17 (B2, B5)和干細(xì)胞標(biāo)記物OCT4 (B3, B6)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，來(lái)自hiPS細(xì)胞系ChiPSC6b和P11025的DE細(xì)胞中存在少量OCT4免疫陽(yáng)性細(xì)胞核，而大多數(shù)SOX17免疫陽(yáng)性細(xì)胞核。細(xì)胞核用DAPI染色(B1, B4)。

實(shí)驗(yàn)方法：
方法
iPS細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化
分化方案由Asplund等人于2016年發(fā)布，并對(duì)成熟階段進(jìn)行了一些修改(Laydon, Bangham, and Asquith 2015)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，iPS細(xì)胞在DEF-CS中以確定的細(xì)胞密度在第0天的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在接下來(lái)的7天內(nèi)，培養(yǎng)基變化產(chǎn)生均勻的DE細(xì)胞，然后酶解并重新鍍上進(jìn)一步的肝細(xì)胞分化。肝細(xì)胞分化培養(yǎng)基引導(dǎo)DE細(xì)胞在體內(nèi)經(jīng)歷與肝臟發(fā)育相同的發(fā)育階段:腹前腸、肝母細(xì)胞、胎兒樣肝細(xì)胞和成熟肝細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程還需要兩個(gè)星期。在這個(gè)過(guò)程的最后，提供的肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基允許功能維持至少11天。

免疫細(xì)胞化學(xué)
細(xì)胞用抗hnf4 α一抗(Santa Cruz Biotechnology)染色，然后用驢抗兔二抗染色，用DAPI反染色(Laydon, Bangham, and Asquith 2015)。將代表性的hnf – α圖像與DAPI合并，并對(duì)hnf – α-DAPI雙陽(yáng)性核的數(shù)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

RT-qPCR
使用OCT4 (Hs01654807_s1)、NANOG-1 (Hs02387400_g1)、SOX17(Hs00751752_s1)、CXCR4(Hs00237052_m1)、SOX7(Hs00846731_s1)、CREBBP (Hs00231733_m1)、AFP (Hs00173490_m1)、Albumin (Hs00910225_m1)、CYP1A2 (Hs01070374_m1)、CYP2C9 (Hs004260376_m1)和CYP3A4 (Hs00604506_m1) TaqMan探針(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。使用ΔΔCt方法計(jì)算表達(dá)水平，歸一化為CREBBP表達(dá)。

CYP活性測(cè)定
細(xì)胞用不含酚紅的溫水水洗兩次(Thermo Fisher Scientific)。溫式WME中加入26μM非那西丁(CYP1A)、50μM甲苯妥英(CYP2C19)、9μM雙氯芬酸(CYP2C9)和3μM咪達(dá)唑侖(CYP3A)，并添加0.1% PEST、25 mM HEPES和2 mM l -谷氨酰胺。2h后，收集100μl上清，-80℃保存，待LC/MS分析撲熱息痛、羥基甲苯妥英、羥基雙氯芬酸和羥基咪達(dá)唑侖。用Pierce BCA蛋白測(cè)定試劑盒(Thermo Fisher Scientific)定量每孔的蛋白量。代謝物濃度按每孔蛋白量和測(cè)定時(shí)間歸一化。

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Y30055 Cellartis? iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System 1 Kit