Takara Bio Europe AB Cellartis人源肝臟細(xì)胞及iPS向肝臟細(xì)胞定向分化相關(guān)產(chǎn)品
Takara旗下Cellartis品牌致力于整個(gè)干細(xì)胞研究用產(chǎn)品的研發(fā)、探索、優(yōu)化、創(chuàng)新，力爭(zhēng)為干細(xì)胞研究者提供基礎(chǔ)研究和應(yīng)用的全套系列產(chǎn)品。Cellartis 目前擁有多款iPS細(xì)胞分化而來(lái)的組織細(xì)胞產(chǎn)品，包括胰腺β細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞，方便您進(jìn)行藥物篩選、疾病研究以及再生醫(yī)學(xué)研究，同樣也可以作為iPS細(xì)胞定向分化為組織細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照。
5月21日，法國(guó)生物公司Cellectis集團(tuán)下的Cellectis干細(xì)胞部宣布推出來(lái)源于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）的肝細(xì)胞產(chǎn)品，即hiPS-HEP。
hiPS-HEP具同質(zhì)性、再生性及生命周期長(zhǎng)且CYP活性穩(wěn)定的特點(diǎn)，能夠?yàn)樗幬锇l(fā)現(xiàn)、毒性試驗(yàn)與疫苗研發(fā)等一系列體外研究提供理想的平臺(tái)。
Cellectis干細(xì)胞部首席科學(xué)家（CSO）Johan Hyllner表示，各醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)間的的高度相關(guān)性會(huì)使hiPS-HEP成為頗具前景的研發(fā)系統(tǒng)。
“制藥企業(yè)迫切需要應(yīng)用于藥物研制早期更佳的、與臨床相關(guān)性更高的模型，以評(píng)價(jià)肝毒性、發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)及研發(fā)新疫苗，”Hyllner 補(bǔ)充道:hiPS-HEP來(lái)源于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS），嚴(yán)格依照質(zhì)量控制和倫理批準(zhǔn)程序。
【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】
Takara Bio Europe AB Cellartis的hiPS-HEP是人肝細(xì)胞來(lái)源的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞細(xì)胞系。細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，游離于細(xì)胞內(nèi)懸浮液，并凍結(jié)在小瓶。Cellartis hiPS-HEP細(xì)胞有涂層基體維護(hù)介質(zhì)補(bǔ)充。
hiPS-HEP具同質(zhì)性、再生性及生命周期長(zhǎng)且CYP活性穩(wěn)定的特點(diǎn)，能夠?yàn)樗幬锇l(fā)現(xiàn)、毒性試驗(yàn)與疫苗研發(fā)等一系列體外研究提供理想的平臺(tái)。
由干細(xì)胞分化而來(lái)的組織細(xì)胞被認(rèn)為是新型藥物開發(fā)篩選的理想模型，具有廣闊的應(yīng)用前景。因?yàn)楦杉?xì)胞分化而來(lái)的組織細(xì)胞可以在體外模擬機(jī)體細(xì)胞對(duì)高新藥物的毒性與效應(yīng)，而且干細(xì)胞可以在體外無(wú)限增殖和分化為多種細(xì)胞類型，避免了從個(gè)體原代細(xì)胞作為材料，取材復(fù)雜、難度大、材料批間差大、無(wú)法長(zhǎng)期穩(wěn)定供應(yīng)等缺點(diǎn)。
iPS向肝臟細(xì)胞定向分化操作系統(tǒng)
(Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System)
以肝臟細(xì)胞為模型的實(shí)驗(yàn)越來(lái)越受到重視，在肝臟病變機(jī)理研究、藥物代謝研究、藥物毒理評(píng)估等方面有廣闊的應(yīng)用前景。然而，以個(gè)體原代肝細(xì)胞為材料來(lái)源會(huì)產(chǎn)生如取材困難、材料批間差大、無(wú)法長(zhǎng)期穩(wěn)定供應(yīng)等一系列難以克服的問(wèn)題。因此，通過(guò)iPS批量轉(zhuǎn)化生產(chǎn)肝細(xì)胞的方法就顯示出特別的優(yōu)勢(shì)。Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System可以穩(wěn)定地、規(guī)?；貙?shí)現(xiàn)iPS向hepatocyte的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，而且誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化出的肝細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)藥物代謝相關(guān)酶系統(tǒng)和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System是一套Do-It-Yourself系統(tǒng)，客戶既可以對(duì)某個(gè)特殊病人來(lái)源的iPS實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，也可以利用cellartis供應(yīng)的iPS進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作。使用本產(chǎn)品的過(guò)程起始于誘導(dǎo)人iPS轉(zhuǎn)化成為確定性內(nèi)胚層（Definitive Endoderm (DE)）細(xì)胞，然后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化DE至肝細(xì)胞。本產(chǎn)品是All-In-One型產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)基、基質(zhì)（coating）等包括在內(nèi)。應(yīng)用本產(chǎn)品轉(zhuǎn)化約3 × 106 hiPS cells,可以獲得約5 × 106 肝細(xì)胞（大約50 cm2面積的單層貼壁細(xì)胞）。
關(guān)于Cellartis 卓越的iPS Cell to Hepatocyte Differentiation技術(shù)的專項(xiàng)說(shuō)明，歡迎來(lái)電咨詢。
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【產(chǎn)品參數(shù)】
Cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基 Y30051
Cellartis肝細(xì)胞分化試劑盒 Y30050
Y30050包裝組成：1瓶肝細(xì)胞解凍培養(yǎng)基 25ml
1瓶肝細(xì)胞干細(xì)胞培養(yǎng)基 50ml
2瓶肝細(xì)胞成熟培養(yǎng)基 24ml
1瓶肝細(xì)胞成熟培養(yǎng)基補(bǔ)充基質(zhì) 2.6ml
3瓶肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基 50ml
1管肝細(xì)胞膜 7.5ml
Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng) Y30020

包裝1:
· 100 ml DEF-CS 100 培養(yǎng)基
· 800 μl DEF-CS COAT-1
包裝 2:
· 300 μl DEF-CS GF-1
· 100 μl DEF-CS GF-2
· 40 μl DEF-CS GF-3

Cellartis定型內(nèi)胚層分化試劑盒 Y30030
包裝組成：10 ml 定形內(nèi)胚層分化涂層?
18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 0
18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 1
18 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 2
25 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 3
47 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 4
47 ml Definitive Endoderm Differentiation Day 6
Cellartis定形內(nèi)胚層分化試劑盒def-cs Y30035
【產(chǎn)品應(yīng)用】
近年來(lái)，人源肝細(xì)胞的需求日益增多。新藥的開發(fā)與應(yīng)用、病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)研究、肝細(xì)胞移植及生物人工肝的研究應(yīng)用等等均需要大量的人源肝細(xì)胞。但人肝細(xì)胞來(lái)源困難，細(xì)胞分離、培養(yǎng)及儲(chǔ)存的技術(shù)尚不完善，體外培養(yǎng)存活時(shí)間短，其供給無(wú)法滿足日益增多的需求。近幾年永生化的人肝細(xì)胞技術(shù)進(jìn)展較快。人肝細(xì)胞在體內(nèi)有極強(qiáng)的增殖能力，而在體外培養(yǎng)時(shí)增殖困難。利用Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System轉(zhuǎn)化得到的肝細(xì)胞除了清晰表現(xiàn)出肝細(xì)胞的必備特征外（如肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物、CYP系列酶等），還保留了原始細(xì)胞供體者的遺傳基因背景。另外，相比較從組織切除獲得的原代肝臟細(xì)胞（通常需要低溫保存），通過(guò)本產(chǎn)品系統(tǒng)轉(zhuǎn)化獲得的肝細(xì)胞在更長(zhǎng)的時(shí)間跨度上保持著生理功能的穩(wěn)定性。這一點(diǎn)對(duì)于毒理學(xué)評(píng)估和病毒感染評(píng)估具有顯著的意義。為長(zhǎng)時(shí)間維持培養(yǎng)hiPS轉(zhuǎn)化而來(lái)的肝細(xì)胞，我們推薦Cellartis?肝細(xì)胞培養(yǎng)基 Cellartis Hepatocyte Maintenance Medium (Cat. No. Y30051)。
【產(chǎn)品特點(diǎn)】
·高重復(fù)性，強(qiáng)大的系統(tǒng)——通過(guò)作用于25個(gè)不同的iPS細(xì)胞得到相同高精確度的科研報(bào)告，沒有必要線性優(yōu)化
·藥物代謝和安全研究的理想細(xì)胞——生成>90%高純度、具有功能性的iPS細(xì)胞
·自定義起始材料開始與任何疾病相關(guān)的iPS細(xì)胞系，創(chuàng)造準(zhǔn)確的肝臟疾病模型
·擴(kuò)展的實(shí)驗(yàn)窗口肝細(xì)胞可用于至少11天的功能測(cè)試
【Cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基操作】
1.解凍hiPS-HEP
一瓶cellartis hiPS-HEP 包含≥1.23 x 107活細(xì)胞。建議細(xì)胞是懸浮在15ml的培養(yǎng)基和鍍?cè)诿芏葹?×105活細(xì)胞/平方厘米（一個(gè)150μL /96孔板或1000μL / 24孔板等）。要計(jì)算活細(xì)胞的數(shù)目，然而，不建議使用超過(guò)15ml的電鍍介質(zhì)/小瓶。
剛解凍的cellartis hiPS-HEP細(xì)胞是很脆弱的。不要用吸管混合細(xì)胞懸液。播種時(shí)只使用吸管。

A.制備
·用Cellartis HEP Coat將Cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋
·準(zhǔn)備和加熱適當(dāng)?shù)慕鈨鼋橘|(zhì)和電鍍介質(zhì)37°C ± 1°C
B.解凍細(xì)胞
1.將小瓶直接從液氮中轉(zhuǎn)移至37°C± 1°C水浴。
2.細(xì)胞懸浮液應(yīng)該解凍，直到有可能把它從小瓶，包括任何冷凍部件。
3.約1分鐘后，檢查細(xì)胞懸浮液是否充分解凍仔細(xì)把瓶子顛倒過(guò)來(lái)。凈化的外表面用適當(dāng)?shù)南緞⑿∑糠湃肷锇踩瘛?br /> 4.解凍后，將細(xì)胞懸液倒入19ml,37°C ± 1°C解凍培養(yǎng)基中。洗瓶以1ml,37°C ± 1°C解凍培養(yǎng)基加入解凍培養(yǎng)基中。
5.小心地將包含細(xì)胞懸浮液的封閉管反轉(zhuǎn)約10次。
6.將細(xì)胞懸液中室溫解凍15–20分鐘。潛伏期較長(zhǎng)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生負(fù)面影響。
7.可選：計(jì)數(shù)活細(xì)胞用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。Aliquot 50μl細(xì)胞懸液，加入5μl臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)，乘以1.1得到活細(xì)胞濃度。細(xì)胞懸浮液含有單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)確保計(jì)數(shù)的活細(xì)胞。
8.離心機(jī)在100 x在RT為2分鐘，
9.用吸管移走解凍介質(zhì)，不干擾細(xì)胞顆粒。松開電池小球彈管和懸浮細(xì)胞顆粒非常小心地慢慢加入15ml 37°C ± 1°C電鍍介質(zhì)。不建議使用超過(guò)15毫升電鍍介質(zhì)/小瓶。
10.拆下cellartis Hep外套從細(xì)胞培養(yǎng)威爾斯之前播種的細(xì)胞。
11.仔細(xì)的種子細(xì)胞，為包覆細(xì)胞培養(yǎng)單元，采用150μL / 96孔板或1000μL / 24孔板。
【多瓶解凍】
幾個(gè)小瓶可以在同一時(shí)間解凍：
·根據(jù)小瓶的數(shù)量（如80ml）增加解凍培養(yǎng)基的體積（4ml/瓶）。倒入解凍細(xì)胞懸浮液
·在50ml離心管中分配細(xì)胞懸液，每管加入不超過(guò)40ml。
·加鍍介質(zhì)按瓶數(shù)（例如，30ml的兩瓶）和同樣將細(xì)胞懸液分配到離心管中。
·細(xì)胞懸液可以匯集來(lái)自不同管播種前結(jié)合成一瓶或一管
【Cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基的維護(hù)】
建議手動(dòng)移液用于介質(zhì)的變化而不是真空泵（使用多通道吸管96孔板）。為了確保細(xì)胞不離開沒有更長(zhǎng)的培養(yǎng)基超過(guò)幾秒鐘，改變介質(zhì)只在四到八wells/time。
A.DAY 1
洗hepatocytes兩次（基地維修中）和改變介質(zhì)（Cellartis Enhanced hiPS-HEP Maintenance Medium，0.5ml/cm2）
1.制備
·準(zhǔn)備和預(yù)熱適量的基礎(chǔ)保養(yǎng)介質(zhì)至37°C ±1°C
·準(zhǔn)備和預(yù)熱完整的培養(yǎng)基
2.介質(zhì)改變
·兩次輕輕洗細(xì)胞預(yù)熱養(yǎng)護(hù)基（0.5ml/cm2）刪除獨(dú)立細(xì)胞。不要使用真空泵，而是手動(dòng)吸管。（使用96孔板的多通道吸管）
·洗滌步驟后，小心地將其放入預(yù)熱的Cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板（0.5ml/cm2）。
·把cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)板放在一個(gè)孵化器（37°C±1°C，5% CO 2，和≥濕度90%)。
·丟棄剩余的預(yù)熱Cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基
DAY 3
介質(zhì)應(yīng)改為2到3次/天。如果離開cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基沒有變化超過(guò)一周，星期五增加50%的介質(zhì)（即，1.5毫升/井一個(gè)24板和230μL / 96孔板等）。最好在星期五晚些時(shí)候或星期一初改變介質(zhì)。
1.制備
解凍cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基
2.介質(zhì)改變
·輕輕地去除約90%的cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基從細(xì)胞培養(yǎng)板維修中丟棄（即最大150μL/96孔板0。不要使用真空泵，而是手動(dòng)。（使用96孔板的多通道吸管)
·很小心地將預(yù)熱的cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板，使用0.47毫升/厘米2（即150μL的每一個(gè)96孔板，每孔0.94毫升/24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板，使用0.47毫升/厘米2（即150μL的每一個(gè)96孔板，每孔0.94毫升/24孔）
·把cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基在37°C±1°C，5% CO 2，和≥濕度90%。
·丟棄剩余的cellartis肝細(xì)胞培養(yǎng)基
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【產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)圖】

肝細(xì)胞分化的免疫細(xì)胞化學(xué)分析：利用cellartis iPS細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的系統(tǒng)，hips細(xì)胞分化為功能性肝細(xì)胞。肝細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色檢測(cè)早期肝細(xì)胞標(biāo)志物14日HNF4α（紅核）和21日CK18（綠色）。由于肝細(xì)胞成熟，28天，肝臟特異性標(biāo)記的CYP3A表達(dá)（紅色，胞漿）和Albumin（綠色）增加。與預(yù)期一樣，細(xì)胞的細(xì)胞核用DAPI染色（藍(lán)色）。
【Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng) Y30020】
Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)是一個(gè)完整的有效的擴(kuò)張和規(guī)模的培養(yǎng)系統(tǒng)，在無(wú)飼養(yǎng)者和定義環(huán)境中的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
圖1解凍、維持（介質(zhì)變化和通道）和人類的冷凍保存示意圖
iPS細(xì)胞在Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)線路如圖1所示。細(xì)胞增殖能力500ml的Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)：20x T25或8x T75或4x T150/燒瓶

人類iPS細(xì)胞系，保持Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)應(yīng)該三到四次/天傳代，每日介質(zhì)變化。當(dāng)細(xì)胞密度稀疏時(shí)，你可以每隔一天更換一次介質(zhì)；然而，重要的是改變媒介后的一天，通過(guò)或解凍，以及前一天通過(guò)或冰凍的.建議細(xì)胞生長(zhǎng)到最大的匯合點(diǎn)1.5 – 3 x 105細(xì)胞/平方厘米。每周進(jìn)度表見表。

未分化的人iPS細(xì)胞保持在其他培養(yǎng)系統(tǒng)可以很容易地轉(zhuǎn)移，到Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)。新鮮的培養(yǎng)基可以在傳代和冷凍培養(yǎng)，解凍后直接使用Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)。它需要2至5通道來(lái)適應(yīng)。
當(dāng)最初將iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)移到這個(gè)系統(tǒng)時(shí)，一些細(xì)胞特性可能與以前使用的培養(yǎng)系統(tǒng)不同。首先，該Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)利用單細(xì)胞傳代，并因此，在Cellartis DEF-CS 100 培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不同的細(xì)胞在使用聚合系統(tǒng)培養(yǎng)傳代方法。其次，新的傳代細(xì)胞容易擴(kuò)散出。然而，增殖時(shí)，細(xì)胞密度更高，典型的未分化干細(xì)胞形態(tài)（即高核質(zhì)比，定義的邊界，突出核仁）出現(xiàn)。
【故障排除】
1、細(xì)胞不分離在通道
太冷tryple選擇酶。確保tryple選擇酶使用前回火。傳代時(shí)傳代細(xì)胞密度不太低。細(xì)胞通常更容易分離在較高密度。傳代時(shí)細(xì)胞密度推薦播種密度通道間隔不是最優(yōu)的，對(duì)于所使用的細(xì)胞系。播種密度和通道間隔需要優(yōu)化。細(xì)胞分化似乎細(xì)胞已被播種太稀疏。確保播種密度是至少4×104細(xì)胞/平方厘米，一些
細(xì)胞株可能需要更高的播種量密度。。
2、轉(zhuǎn)移細(xì)胞不適應(yīng)cellartis def-cs培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞不適用于新的環(huán)境。
細(xì)胞可能受益于更高對(duì)cellartis def-cs濃度coat-1。使用1:10的稀釋或1:5在前幾段提供額外的支持適應(yīng)的過(guò)程。新轉(zhuǎn)移的細(xì)胞可能最初以稍慢的速度增長(zhǎng)。延長(zhǎng)通道間隔長(zhǎng)達(dá)7天。
3、細(xì)胞不粘附在通道或解凍def-cs coat-1被攤薄。
在杜貝爾科磷酸鹽緩沖鹽水–/–。確保使用杜貝爾科磷酸鹽緩沖鹽水與Mg2+
和Ca2+。延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間def-cs coat-1。
4、細(xì)胞稀疏，即使在七天中培養(yǎng)通道上附著的細(xì)胞太少。
增加播種密度。即使在七天中文化所使用的細(xì)胞增加GF-1體積增長(zhǎng)速度緩慢，使用最大1:111稀釋。

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