Indo 1-AM 的操作說(shuō)明(for Human T cells)
試劑:
2 mM的Indo 1-AM/DMSO
Pluronic F127
Hanks' balanced salt solution (HBSS)
HEPES buffer saline (10 mM HEPES, 1 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 5 mM glucose, 0.1% BSA, pH 7.4)
操作:
1. 配制2mM的Indo 1-AM/DMSO溶液即：將1mg Indo 1-AM溶于495ulDMSO中（推薦現(xiàn)配現(xiàn)用）。
2.Pluronic F127先用DMSO配制成5%（W/V）的溶液，室溫保存。使用時(shí)加入到上述Indo 1-AM/DMSO溶液至終濃度0.05%（W/V）.
Pluronic F127可以防止Indo 1-AM在HBSS中聚合并能幫助其進(jìn)入細(xì)胞。
3. 用HBSS稀釋Indo 1-AM溶液，制備4 µM的Indo 1-AM working solution。
4. 將Indo 1-AM working solution加入細(xì)胞，在37 ℃培養(yǎng)20分鐘。
5. 加入5倍體積的含有1%胎牛血清的HBSS，再繼續(xù)培養(yǎng)40分鐘。
6. 用HEPES buffer saline洗滌細(xì)胞3次，然后用HEPES buffer saline使細(xì)胞重懸浮，制成1x105 cells/ml的溶液。
7. 37 ℃下培養(yǎng)10 分鐘，然后用該細(xì)胞進(jìn)行熒光鈣離子檢測(cè)。
8. 觀察528 nm (excitation: 490-500 nm)時(shí)的熒光。
*標(biāo)記的條件因細(xì)胞種類而異，在每次實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)先確定最佳條件。以上方法僅供參考。