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當(dāng)前位置：

ProteanFect Max 轉(zhuǎn)染試劑盒：提供免疫細(xì)胞高效、低毒性的核酸轉(zhuǎn)染解決方案

產(chǎn)品名稱(chēng)：ProteanFect Max 轉(zhuǎn)染試劑盒
規(guī)格：多種規(guī)格可選
簡(jiǎn)介：ProteanFect Max 轉(zhuǎn)染試劑盒是全球首款自組裝蛋白納米顆粒核酸轉(zhuǎn)染試劑，專(zhuān)為原代細(xì)胞與難轉(zhuǎn)細(xì)胞系設(shè)計(jì)，能夠?qū)崿F(xiàn)卓越的外源基因遞送與表達(dá)。作為一種非病毒、非電轉(zhuǎn)、非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑，ProteanFect Max 能高效且低毒性地轉(zhuǎn)染 mRNA、siRNA、DNA 等多種核酸。該試劑操作簡(jiǎn)便，僅需 5-15 分鐘即可將核酸遞送至細(xì)胞內(nèi)，最快在 1 小時(shí)內(nèi)觀察到 mRNA 的表達(dá)效果。
產(chǎn)品特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)：
  • 高效轉(zhuǎn)染：能夠高效轉(zhuǎn)染 mRNA、siRNA、DNA 等多種核酸，適用于多種細(xì)胞類(lèi)型。
  • 低毒性：對(duì)細(xì)胞的損傷小，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)快。
  • 操作簡(jiǎn)便：僅需 5-15 分鐘即可完成轉(zhuǎn)染，最快 1 小時(shí)內(nèi)觀察到 mRNA 表達(dá)。
  • 適用廣泛：適用于原代細(xì)胞和難轉(zhuǎn)細(xì)胞系，如人原代 T 細(xì)胞、Jurkat T 細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞等。
  • 陽(yáng)性對(duì)照：試劑盒包含編碼綠色熒光蛋白（EGFP）的 mRNA 和質(zhì)粒 DNA，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)操作及試劑效果。
產(chǎn)品應(yīng)用：
  • 基因表達(dá)研究：快速高效地將目標(biāo)基因遞送至細(xì)胞內(nèi)，觀察基因表達(dá)效果。
  • RNA干擾研究：通過(guò) siRNA 轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)基因沉默，研究基因功能。
  • 細(xì)胞功能研究：在原代細(xì)胞和細(xì)胞系中進(jìn)行功能研究，如細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等。
儲(chǔ)存與運(yùn)輸條件：
  • 儲(chǔ)存條件：Reagent A 和 Reagent C 打開(kāi)使用后保存于 2-8℃，Reagent B 保存于 -20℃，避免反復(fù)凍融。
  • 運(yùn)輸條件：干冰運(yùn)輸，收到后應(yīng)存放于 -20℃，直至使用。
實(shí)驗(yàn)前材料準(zhǔn)備：
  • 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前細(xì)胞必須處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，活率＞90%。對(duì)于原代細(xì)胞，建議在適當(dāng)活化后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
  • 推薦培養(yǎng)基：Opti-MEM 培養(yǎng)基（或無(wú)血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基/無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)基），提前預(yù)熱或恢復(fù)至室溫。
  • 其他：完全培養(yǎng)基，無(wú)菌 EP 管、所需轉(zhuǎn)染的核酸樣品。
實(shí)驗(yàn)操作步驟：
  1. 配置 ProteanFect 轉(zhuǎn)染體系：
    • 在 40 μL Reagent A 中加入 0.5 μg mRNA，充分混勻。
    • 加入 1.4 μL Reagent B，輕柔充分混勻。
    • 對(duì)于原代細(xì)胞，加入 8 μL Reagent C 混勻。
  2. 細(xì)胞處理：
    • 懸浮細(xì)胞：300 g 離心 5 分鐘，收集細(xì)胞沉淀，用 Opti-MEM 重懸并洗滌，調(diào)至 5×10? – 1×10? cells/mL 備用。
    • 貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前匯合率應(yīng)保持在 50%-80%，用 Opti-MEM 輕柔清洗細(xì)胞兩次，加入 20 μL Opti-MEM 備用。
  3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：
    • 將配置好的 ProteanFect 轉(zhuǎn)染體系與 20 μL 細(xì)胞懸液或貼壁細(xì)胞混合均勻。
    • 37℃孵育 45-60 分鐘（細(xì)胞系）或 15-30 分鐘（原代細(xì)胞）。
    • 加入至少 200 μL 完全培養(yǎng)基，300 g 離心 5 分鐘，棄上清（為避免細(xì)胞損失，無(wú)需完全棄盡）；對(duì)于貼壁細(xì)胞，直接棄去混合液，補(bǔ)加培養(yǎng)基。
    • 加入適量完全培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，后續(xù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)。
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案：
  1. 如何提升轉(zhuǎn)染效率：
    • 延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間：根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間。通常原代細(xì)胞不超過(guò) 1 小時(shí)，細(xì)胞系不超過(guò) 2 小時(shí)。
    • 提升 Reagent B 用量：適當(dāng)增加 Reagent B 的用量，以 96 孔板為例，原代細(xì)胞推薦為 0.7-1.4 μL，細(xì)胞系為 1-3 μL。
    • 提升 Reagent C 用量：對(duì)于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染，可在體系中添加適當(dāng)?shù)?Reagent C，以 96 孔板為例，添加 8-13.5 μL，孵育 15 分鐘，最長(zhǎng)不超過(guò) 45 分鐘；原代細(xì)胞則可將 Reagent C 體積增加至 13.5 μL，孵育時(shí)間同樣不超過(guò) 45 分鐘。
    • 提升 ProteanFect 轉(zhuǎn)染量：適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染體系至初始的 1.5-2.5 倍。
  2. 質(zhì)粒 DNA 能否用于原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染：
    • 雙鏈 DNA 轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞可能引起一定的毒性，例如炎癥應(yīng)激，因此需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹?jǐn)慎選擇。以人或小鼠來(lái)源的原代 T 細(xì)胞為例，使用質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染可能導(dǎo)致顯著的細(xì)胞毒性，因此不適合此類(lèi)細(xì)胞。而大多細(xì)胞系通常經(jīng)過(guò)多代培養(yǎng)，能更有效地應(yīng)對(duì)外源 DNA 帶來(lái)的壓力，對(duì)雙鏈 DNA 轉(zhuǎn)染的耐受性較高，因此可以使用質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
  3. 質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染要求：
    • 轉(zhuǎn)染效率受 DNA 質(zhì)量影響。建議使用無(wú)內(nèi)毒素試劑盒制備 DNA，并確保 OD 值在 1.7-1.9 之間；使用無(wú)核酸酶純水將 DNA 稀釋至 0.5-2 μg/μL 的濃度。
  4. 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染前處理：
    • 為獲得良好的轉(zhuǎn)染效率，建議使用活性超過(guò) 90%的細(xì)胞，可以通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活性。
    • 不建議使用傳代次數(shù)超過(guò) 15 次的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
    • 新復(fù)蘇的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前需傳代 2-3 次，待細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)后使用。
  5. 原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染前預(yù)處理：
    • 對(duì)于原代細(xì)胞，充分活化有助于提高轉(zhuǎn)染效率，因此建議在適當(dāng)活化后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。例如，人原代 T 細(xì)胞可使用 CD3/CD28 磁珠或抗體進(jìn)行激活，激活 2-10 天內(nèi)均可轉(zhuǎn)染，其中激活 4-6 天時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高。
  6. 關(guān)于試劑盒中陽(yáng)性對(duì)照的使用建議：
    • 首次嘗試時(shí)，建議設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（EGFP mRNA 或 EGFP pDNA），以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作和試劑的有效性。使用 96 孔板的細(xì)胞量即可，節(jié)省細(xì)胞和試劑。
  7. 轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞數(shù)范圍：
    • 說(shuō)明書(shū)中提供了最佳轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞數(shù)量范圍，但在特殊情況下，即使細(xì)胞數(shù)量較少，也可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以 96 孔板為例，建議細(xì)胞數(shù)量不低于 4×103/孔，以確保后續(xù)檢測(cè)的可靠性。
  8. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)與活力：
    • 轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞狀態(tài)可能與未處理組略有差異。但使用 ProteanFect 試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力的損傷較小。通常在轉(zhuǎn)染后第二天，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)基本恢復(fù)。
  9. 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞離心后看不到沉淀：
    • 對(duì)于小體積轉(zhuǎn)染體系（如 96 孔板），離心后細(xì)胞沉淀不明顯是正?，F(xiàn)象。細(xì)胞沉淀可能散落在離心管側(cè)壁，不影響后續(xù)結(jié)果。為減少細(xì)胞損失，離心后移液時(shí)應(yīng)避免槍頭緊貼底部。
  10. 轉(zhuǎn)染體系擴(kuò)大是否影響轉(zhuǎn)染效率：
    • 如轉(zhuǎn)染細(xì)胞量較大，推薦使用離心管進(jìn)行孵育，轉(zhuǎn)染體系參照表 4，不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。
  11. 貼壁細(xì)胞如何轉(zhuǎn)染：
    • 對(duì)于貼壁細(xì)胞，可提前一天種板后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，也可消化成細(xì)胞懸液進(jìn)行
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