Cholesterol plaque in blood vessel, 3D illustration

所以，推測(cè)產(chǎn)生的治療作用可能是依賴于旁分泌機(jī)制產(chǎn)生的大量生物活性因子。大多數(shù)健康或疾病環(huán)境的細(xì)胞能夠持續(xù)釋放細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）進(jìn)入周圍環(huán)境，其中外泌體作為細(xì)胞間進(jìn)行信息交流的重要工具有望替代干細(xì)胞移植。

MSC?來源的外泌體已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，主要針對(duì)急性缺血性腦中風(fēng)、難治性黃斑孔裂、1?型糖尿病和阿爾茨海默癥。因此，對(duì)外泌體的培養(yǎng)方法和相關(guān)參數(shù)、分離方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，對(duì)其蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)行嚴(yán)格分析均是其應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)。

1983?年，Johnstone?等首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)外泌體，但一直被認(rèn)為是一種細(xì)胞廢棄物。2010?年?MSC?來源外泌體首次在心肌缺血/再灌注損傷模型中被研究。研究表明，骨髓?MSC?比成肌細(xì)胞、人急性單細(xì)胞白血病細(xì)胞系（THP-1）、人胚胎腎細(xì)胞系（HEK）等能產(chǎn)生更多的外泌體。

體外培養(yǎng)人 MSC 外泌體的臨床應(yīng)用研究

MSC?來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多功能干細(xì)胞，其具有多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，是干細(xì)胞家族的重要成員，存在于骨髓、肝臟、脾臟、成人的骨骼肌、外周血、脂肪、韌帶、胎盤、臍帶、臍血、皮膚等組織中。2006?年國(guó)際間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)對(duì)人來源?MSC?實(shí)驗(yàn)研究提出?3?條最低鑒定標(biāo)準(zhǔn)：

①在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，MSC?必須具備對(duì)塑料底物的貼附特性；

②通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，MSC?群體表達(dá)?CD105、CD73及?CD90?陽性率?≥?95%，且?CD45、CD34、CD14?或CD11b、CD79a?或?CD19、HLA-DR?的陰性表達(dá)率?≥?98%；

③在體外，通過標(biāo)準(zhǔn)方法誘導(dǎo)，MSC?必須能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化。

臨床試驗(yàn)中可能需要數(shù)百微克至毫克的外泌體來治療患者，原代?MSC?數(shù)量很少，可以通過體外擴(kuò)增培養(yǎng)，控制培養(yǎng)微環(huán)境來增加外泌體的產(chǎn)量和誘導(dǎo)有效成分的高表達(dá)。

目前常用的培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生?EVs?體系有?2D?培養(yǎng)體系、3D?培養(yǎng)體系（包括支架和無支架）和生物反應(yīng)器。3D?培養(yǎng)體系可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)?2D?培養(yǎng)體系在生理模式方面的缺失，但?3D?培養(yǎng)體系其支架組成會(huì)影響?EVs?的數(shù)量和質(zhì)量，且更難去評(píng)估，再現(xiàn)性和可伸縮性也應(yīng)該被考慮，EVs的分離需要用酶進(jìn)行消化，會(huì)影響?EV?的完整性和生物活性。生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)在于?EV?的產(chǎn)量大，且在動(dòng)態(tài)條件下培養(yǎng)，可以增強(qiáng)生物反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)交換，但也必然會(huì)給?EV?的功能和特性帶來影響，例如，細(xì)胞接種的密度、老化程度、增殖代數(shù)、分化的不同時(shí)期、培養(yǎng)基基質(zhì)的形貌、剛性、流體剪切應(yīng)力以及周期性拉伸等細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境下的因素均會(huì)對(duì)?EV?產(chǎn)生影響。細(xì)胞接種密度過大，會(huì)產(chǎn)生接觸抑制。

目前仍存在很多問題如外泌體提取的純度和產(chǎn)量、治療疾病的作用機(jī)理不明確以及攜帶的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA 和miRNA 是否會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生其他危害等等。盡管有諸多限制條件,MSC-Ex 在疾病的治療方面仍然具有廣泛的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

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