自2012年“魔剪”技術(shù)出道以來，該技術(shù)一直備受爭(zhēng)議。一些專家指出，基因編輯在很多層面上難以實(shí)現(xiàn)控制。近年來，科學(xué)家一直致力于開發(fā)“抗CRISPR”系統(tǒng)，來干擾細(xì)胞中的Cas核酸酶功能，以此來給CRISPR基因編輯技術(shù)帶上一定程度的“鐐銬”，規(guī)范該技術(shù)的使用操作。
如今，在美國Broad研究所開發(fā)的高通量檢測(cè)方法下，這一“抗CRISPR”系統(tǒng)迎來了第一位成員：SpCas9(化膿性鏈球菌 Cas9)的小分子抑制劑。相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)表在《Cell》雜志上。
DOI：https ：//doi.org/10.1016/j.cell.2019.04.009
CRISPR-Cas9與SpCas9
最新研究表明，許多基因工程技術(shù)的實(shí)施都需要依賴準(zhǔn)確地CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行有效控制才能保證基因編輯的準(zhǔn)確有效性。而Cas9在CRISPR基因編輯技術(shù)中作為最常用DNA切割酶，十分容易引起基因組的改變。我們發(fā)現(xiàn)它在細(xì)菌的膿性鏈球菌 Cas9（SpCas9）上存在量較多。
目前SpCas9正被開發(fā)為多種疾病的基因治療藥物，包括HIV、視力障礙、肌肉萎縮癥和其他遺傳性疾病等。然而，治療中不斷高發(fā)的脫靶效應(yīng)、染色體易位、基因毒性等副作用，讓治療手段尤其是對(duì)SpCas9的治療劑量和時(shí)間的調(diào)控變得尤為重要。
來自美國Broad研究所的Amit Choudhary博士及其同事最終也將“抗CRISPR”的研究目光也鎖定在Cas9的最初來源的膿性鏈球菌 Cas9（SpCas9）上。同時(shí)，他們通過一系列生化和細(xì)胞水平的測(cè)定，篩選出針對(duì)SpCas9的小分子抑制劑，使得對(duì)“抗CRISPR-Cas9”基因編輯系統(tǒng)有了更加行之有效的控制。
Amit Choudhary博士 圖片來源：Vilcek Foundation
SpCas9小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)
在此研究之前，科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白的存在，但這類蛋白體積很大，而且不易被細(xì)胞滲透，在作用中不可逆轉(zhuǎn)，還存在可能被蛋白酶降解的風(fēng)險(xiǎn)，甚至可能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)造成不良免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
因此，在此研究中，研究人員選取小分子作為“抗CRISPR”蛋白的新型對(duì)象，篩選出一組多樣化的小分子，通過識(shí)別化合物結(jié)構(gòu)來破壞SpCas9與DNA的結(jié)合，從而達(dá)到干擾SpCas9對(duì)DNA進(jìn)行切割的作用。
高通量初級(jí)和二級(jí)分析
研究人員還發(fā)現(xiàn)，這些小分子抑制劑可以穩(wěn)定地進(jìn)入細(xì)胞，且比先前發(fā)現(xiàn)的一些抗CRISPR蛋白要小的多，同時(shí)這樣的小分子抑制劑能夠?qū)pCas9實(shí)現(xiàn)行動(dòng)可逆，劑量可控，相對(duì)穩(wěn)定且溫和的控制。這樣的“抗CRISPR蛋白”抑制劑的發(fā)現(xiàn)，對(duì)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯，堿基編輯，和表觀遺傳編輯具有重要意義。
SpCas9的小分子抑制劑的鑒定和驗(yàn)證
Amit Choudhary博士對(duì)此項(xiàng)研究評(píng)價(jià)道：“這些研究結(jié)果為精確控制CRISPR-Cas9活性奠定了基礎(chǔ)。然而，這些分子抑制劑目前還沒有在生物體內(nèi)進(jìn)行有效性測(cè)試，距離人類應(yīng)用還有很長(zhǎng)一段路要走?！?/span>
接下來，研究人員將致力于兩個(gè)方向的研究：第一，確定這類抑制劑在SpCas9：gRNA復(fù)合物上的結(jié)合位點(diǎn)，并檢查其作用機(jī)制，優(yōu)化其效力。第二，確定這類分子抑制劑能否作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的其他靶標(biāo)，并評(píng)估它們對(duì)其他CRISPR相關(guān)核酸酶的特異性。
參考文獻(xiàn)：
[1]?A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9
[2]?CRISPR Under Control: Small-Molecule Inhibitors of Cas9 Identified
[3]?Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy