近年二代基因測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)快速發(fā)展，其應(yīng)用已進(jìn)展至臨床檢測(cè)，如遺傳疾病、實(shí)體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細(xì)胞抗原分析及非侵襲性產(chǎn)前篩查等。中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)和中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤病理專委會(huì)前期組織病理、臨床、生物信息等專家進(jìn)行了充分討論，擬在 NGS 的操作流程、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果解讀等方面作規(guī)范和建議，以規(guī)范 NGS 在分子病理領(lǐng)域的應(yīng)用。

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臨床分子病理實(shí)驗(yàn)室 NGS 樣（formalin-fixedparaffin-embedded，F(xiàn)FPE）、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細(xì)胞塊、石蠟包埋標(biāo)本和血漿 / 血液標(biāo)本等。本共識(shí)特色是基于病理評(píng)估的組織樣本（FFPE、新鮮）的規(guī)范。測(cè)序分析范圍基于目前臨床需求，本共識(shí)著重在于目標(biāo)區(qū)域測(cè)序（panel）分析的實(shí)踐。隨著技術(shù)的更新和應(yīng)用的成熟，本共識(shí)將持續(xù)更新以滿足臨床需求。

一、實(shí)驗(yàn)室總體要求

1. NGS 檢測(cè)人員的資質(zhì)要求：NGS 檢測(cè)技術(shù)人員應(yīng)具備臨床病理學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)專業(yè)大專以上學(xué)歷，并經(jīng)過(guò) NGS 技術(shù)的理論與技能培訓(xùn)合格。數(shù)據(jù)分析人員應(yīng)具有臨床醫(yī)學(xué)或分子生物學(xué)或遺傳學(xué)知識(shí)背景并經(jīng)生物信息學(xué)培訓(xùn)。最終報(bào)告應(yīng)由中級(jí)或碩士以上具有病理學(xué)背景、經(jīng)培訓(xùn)合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或者授權(quán)簽字人 (醫(yī)學(xué)博士學(xué)位或高級(jí)職稱) 審核。

2. NGS 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的區(qū)域設(shè)置要求：原則上 NGS 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)有以下分區(qū)：樣本前處理區(qū)、試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫(kù)制備區(qū)、雜交捕獲區(qū) / 多重 PCR 區(qū)域（第一擴(kuò)增區(qū)）、文庫(kù)擴(kuò)增區(qū)（第二擴(kuò)增區(qū)）、文庫(kù)檢測(cè)與質(zhì)控區(qū)、測(cè)序區(qū)、數(shù)據(jù)存貯區(qū)。各工作區(qū)空氣及人員流向需要嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》。分區(qū)可根據(jù)實(shí)際情況合并，但是在前處理和建庫(kù)時(shí)，血液樣本應(yīng)與組織樣本分開(kāi)。

3. NGS 檢測(cè)試劑及項(xiàng)目要求：試劑和測(cè)序平臺(tái)均應(yīng)選擇中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局 (CFDA) 認(rèn)可產(chǎn)品。涉及到實(shí)驗(yàn)室自配試劑，應(yīng)該有嚴(yán)格的試劑制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），需經(jīng)過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目 (LDT) 驗(yàn)證合格才可使用。每個(gè) NGS 檢測(cè)項(xiàng)目在驗(yàn)證時(shí)需要根據(jù)建庫(kù)方法、測(cè)序平臺(tái)和分析工具以及不同的突變類型包括，單堿基突變 single nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷貝數(shù)變異 Copynumber variations（CNVs）、染色體結(jié)構(gòu)變異，structuralvariation（SVs）以及不同的樣本類型（如 FFPE 組織、新鮮組織、全血、胸水等）對(duì)特定 panel 的準(zhǔn)確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數(shù)進(jìn)行 LDT 驗(yàn)證。應(yīng)該有經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的在不同的 mutant allele frequencies（MAF）下，不同測(cè)序深度的靈敏度及特異性數(shù)據(jù)，確定不同樣本的可信的測(cè)序深度。經(jīng)驗(yàn)證后，SOP 發(fā)生的任何改動(dòng)，包括試劑、儀器、基因項(xiàng)目等都需要重新做驗(yàn)證。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果簽名留底備案。

4. NGS 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理要求：NGS 檢測(cè)主要包括實(shí)驗(yàn)操作和生物信息學(xué)分析兩部分。實(shí)驗(yàn)操作部分包括樣本準(zhǔn)備、文庫(kù)制備、編碼（barcoding）、目標(biāo)區(qū)域富集、測(cè)序等；生物信息學(xué)分析部分包括定位（mapping）、比對(duì)、變異識(shí)別、變異注釋、變異解讀及報(bào)告等。上述流程均需要建立實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系文件和 SOP 及機(jī)器運(yùn)行和維護(hù) SOP，具有嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控措施；定期參加室間質(zhì)評(píng)以有及持續(xù)的質(zhì)量保證和改進(jìn)計(jì)劃。

二、NGS 分析樣本、基因 panel 和轉(zhuǎn)運(yùn)要求

? NGS 分析樣本類型可采用 FFPE 樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細(xì)胞塊石蠟包埋標(biāo)本和血漿 / 血液標(biāo)本等。
? 對(duì)于腫瘤體細(xì)胞變異初次 NGS 檢測(cè)應(yīng)首-選經(jīng)病理評(píng)估的組織樣本，在此數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上的再次檢測(cè)可選取液體樣本動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
? NGS 檢測(cè)前需通過(guò)病理診斷明確其腫瘤的性質(zhì)及含量，根據(jù)不同腫瘤類型選擇合適的基因 panel 測(cè)序。
? 不同疾病的基因 panel 列表，必須由臨床與檢測(cè)機(jī)構(gòu)的專家共同決定，已達(dá)到不同實(shí)驗(yàn)室之間的可比性和完善性。
? 未經(jīng)病理評(píng)估的基因檢測(cè)結(jié)果不可單獨(dú)用于分子病理臨床診斷目的。
? 樣本質(zhì)量對(duì)檢測(cè)結(jié)果和分析至關(guān)重要，病理醫(yī)師需要對(duì)可評(píng)估的樣本進(jìn)一步明確病理診斷，并評(píng)價(jià)標(biāo)本有無(wú)出血、壞死和不利于核酸檢測(cè)的前處理（例如含 HCl 脫鈣液處理），病變細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞含量建議達(dá)到 20% 以上，低于此標(biāo)準(zhǔn)可富集后檢測(cè)。
? NGS 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)不同類型的樣本有采集及處理 SOP 指導(dǎo)。對(duì)于不同的樣本（FFPE、體液、血液等）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有不同的樣本運(yùn)送 SOP，物流環(huán)節(jié)（含冷鏈運(yùn)輸）應(yīng)有相關(guān)運(yùn)送記錄，確保樣本運(yùn)送安全、無(wú)污染、無(wú)降解。

三、NGS 檢測(cè)流程中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1. 核酸提取及其質(zhì)量分析：提取的核酸質(zhì)量是 NGS 檢測(cè)成功的關(guān)鍵因素，在制備文庫(kù)前應(yīng)采用多種方法對(duì)核酸質(zhì)量評(píng)估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據(jù)不同的樣本類型制定相應(yīng)的 SOP 用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對(duì)應(yīng)明確接受和拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。

2. 文庫(kù)制備及其質(zhì)量分析：文庫(kù)制備方法主要有雜交捕獲和擴(kuò)增子建庫(kù)，無(wú)論采用何種方法制備文庫(kù)和平臺(tái)檢測(cè)，都應(yīng)對(duì)檢測(cè)基因、區(qū)域或突變熱點(diǎn)進(jìn)行描述，并建立實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) SOP。建立好文庫(kù)后上機(jī)測(cè)序前需對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量分析。每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)設(shè)定其文庫(kù)質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。

3. NGS 測(cè)序儀上機(jī)分析及其質(zhì)量分析：NGS 建庫(kù)主要有擴(kuò)增法和捕獲法兩大策略，測(cè)序時(shí)根據(jù)檢測(cè)樣本量和質(zhì)量要求確定適當(dāng)?shù)男酒员ＷC測(cè)序質(zhì)量和靶區(qū)覆蓋深度。錄入樣本編號(hào)、檢測(cè)內(nèi)容、設(shè)定參數(shù)等信息，按儀器操作流程進(jìn)行測(cè)序。

4. NGS 檢測(cè)中的樣本追蹤及對(duì)照設(shè)置：
（1）樣本追蹤：為確保檢測(cè)過(guò)程中樣本沒(méi)有混淆或污染，可選用多個(gè) SNV 位點(diǎn)或其他標(biāo)簽作為樣本身份標(biāo)識(shí)（sample ID），在檢測(cè)前對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行 SNV 位點(diǎn)信息的測(cè)定，在 NGS 檢測(cè)后對(duì)上述位點(diǎn)進(jìn)行追蹤，證明沒(méi)有交叉污染。
（2）陽(yáng)性對(duì)照：應(yīng)用組合型質(zhì)控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復(fù)雜性。實(shí)驗(yàn)時(shí)同時(shí)檢測(cè)，以確保其檢出能力。
（3）陰性對(duì)照：用無(wú)核酸或明確無(wú)突變的樣本作為模板同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，以確保檢測(cè)過(guò)程中沒(méi)有污染或非特異性。
（4）應(yīng)對(duì)方案和替代方法：各個(gè)質(zhì)量控制步驟中如出現(xiàn)異常或失敗，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有應(yīng)對(duì)措施或備選方案；對(duì)于測(cè)序結(jié)果質(zhì)量差或有問(wèn)題的區(qū)域應(yīng)建立替代方法（如 Sanger 測(cè)序）。

四、生物信息分析

NGS 數(shù)據(jù)的生物信息分析可分為兩個(gè)主要步驟：一是對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析及過(guò)濾。二是對(duì)通過(guò)質(zhì)控的序列進(jìn)行變異位點(diǎn)鑒定分析并注釋。所用各種生物信息分析軟件，都要通過(guò)適量標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，證明所用軟件及參數(shù)可達(dá)到臨床報(bào)告的要求。

1. NGS 生物信息分析流程標(biāo)準(zhǔn)：
（1）質(zhì)控分析：為保證分析結(jié)果的可靠性，需要對(duì)原始的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制與過(guò)濾。測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制主要包含 4 個(gè)方面：質(zhì)量評(píng)估、去接頭序列、去低質(zhì)量序列、去重復(fù)序列。
（2）序列比對(duì)（mapping）：將通過(guò)質(zhì)控后每一條 read 與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，回貼到基因組上最佳位置。
（3）變異鑒定：對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行變異鑒定。在腫瘤 panel 測(cè)序中，主要檢測(cè) SNV 和 Indel 兩種突變類型，參數(shù)調(diào)整后可分析 CNV。部分 panel 的設(shè)計(jì)還可以鑒定染色體易位。對(duì)于腫瘤 panel 基因測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定后的變異位點(diǎn)都需要進(jìn)行該位點(diǎn)可視化查看和確認(rèn)，如 The IntegrativeGenomics Viewer (IGV)。
（4）變異注釋：基于通用數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)突變基因位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋，詳見(jiàn)下文。

2. NGS 生物信息分析流程質(zhì)量管理：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立生物信息學(xué)程序 /Pipeline 的書(shū)面質(zhì)量管理 (QM) 計(jì)劃文件。必須包含每次運(yùn)行時(shí)監(jiān)測(cè)和評(píng)估運(yùn)行性能的指標(biāo)和質(zhì)控參數(shù)，以及定期（例如每月、每季度）監(jiān)測(cè)的指標(biāo)和質(zhì)控參數(shù)。指標(biāo)和質(zhì)控參數(shù)可包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)品的突變類型及百分比。生物信息分析流程建立后，需要采用已知變異類型和變異頻率的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證其特異性和靈敏度是否達(dá)到實(shí)驗(yàn)室要求。驗(yàn)證結(jié)果簽名留底備案。
（1）NGS 數(shù)據(jù)存儲(chǔ)：實(shí)驗(yàn)室需要在生物信息分析過(guò)程中對(duì)原始數(shù)據(jù)及最后的結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化存儲(chǔ)，并要保存相應(yīng)的年限以備查。
（2）版本可追溯性：每份病例數(shù)據(jù)分析報(bào)告中，生物信息數(shù)據(jù)分析流程所涉及軟件、算法、參數(shù)及數(shù)據(jù)庫(kù)的版本必須可溯源。
（3）異常記錄。實(shí)驗(yàn)室需要建立一個(gè)異常記錄文檔，用來(lái)記錄偏離 NGS 生物信息分析標(biāo)準(zhǔn)分析流程的檢測(cè)。

3. NGS 生物信息分析質(zhì)量指標(biāo)

4. NGS 數(shù)據(jù)存儲(chǔ)格式標(biāo)準(zhǔn)：為了規(guī)范和管理各類數(shù)據(jù)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室需按照編號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)管理，所有數(shù)據(jù)按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)格式進(jìn)行存儲(chǔ)。必須建立本地變異數(shù)據(jù)庫(kù)（用于檢驗(yàn)變異真實(shí)性）。

5. NGS 數(shù)據(jù)存儲(chǔ)傳輸及共享安全標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)室需要制定規(guī)章制度以確認(rèn)測(cè)序。數(shù)據(jù)在內(nèi)部及外部存儲(chǔ)及傳輸過(guò)程中的安全性和機(jī)密性。正常人群的變異數(shù)據(jù)應(yīng)該共享。

五、NGS 結(jié)果解釋及報(bào)告

1. NGS 臨床報(bào)告包含內(nèi)容：基于高通量測(cè)序技術(shù)，臨床實(shí)驗(yàn)室比較容易的獲取更高通量的臨床樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)，不可避免會(huì)檢測(cè)到意義未知的變異位點(diǎn)，在實(shí)際工作中會(huì)有一定的不確定性。

2. 基因變異的命名：在描述所檢測(cè)出的基因變異時(shí)要遵循一定的原則和規(guī)范，推薦使用人類基因組變異協(xié)會(huì)命名指南。對(duì)于遺傳病相關(guān)基因變異命名，推薦美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)院

3. 臨床意義的解讀和批注：對(duì)于腫瘤體細(xì)胞突變，根據(jù)突變的類型和已有的報(bào)道及指南，基因變異提倡分級(jí)的處理方式

4. B 級(jí)：尚未進(jìn)入診療指南，但已經(jīng)寫(xiě)入該領(lǐng)域的專家共識(shí)的變異位點(diǎn)。注釋時(shí)要批注研究報(bào)道及專家共識(shí)的來(lái)源，明確其藥物及其臨床意義、正在開(kāi)展的狀態(tài)等信息。
? ? C 級(jí)：FDA 或 CFDA 批準(zhǔn)用于其他腫瘤可預(yù)測(cè)療效的基因變異，或者正在進(jìn)行中的臨床試驗(yàn)變異位點(diǎn)。注釋時(shí)要批注用于其他腫瘤的權(quán)威指南，研究文獻(xiàn)及臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展的狀態(tài)等信息。
? ? D 級(jí)：處于學(xué)術(shù)爭(zhēng)議或臨床意義不明確的基因變異。同一實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有統(tǒng)一的政策用來(lái)應(yīng)對(duì)檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的臨床意義不明變異情況。
對(duì)于以上幾種情況在報(bào)告的時(shí)候注意客觀平實(shí)地描述檢測(cè)的結(jié)果，在病理報(bào)告中不能出現(xiàn)建議使用何種治療手段或策略的語(yǔ)言。

5. 意義不明位點(diǎn)的處理：由于通量的增加和人種差異，臨床腫瘤樣本可能發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室必須制定相關(guān)政策方案用來(lái)應(yīng)對(duì)檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的臨床意義不明變異情況。政策可以是一發(fā)現(xiàn)變異就報(bào)告，但附上說(shuō)明和意義。也可以是不報(bào)道這些發(fā)現(xiàn)或只報(bào)道小部分變異結(jié)果。