另外一個能夠?qū)е赂弑尘暗脑蚴菦]有進行恰當?shù)牟僮鞑襟E。差的膜操作，膜過度曝光，?以及不足的漂洗都會導致高背景。這些問題可以通過恰當操作來解決。當膜變干的時候膜的糟糕操作通常會發(fā)生。如果沒有使用正確的化學試劑恰當?shù)臐櫇衲兏??通常來說是甲醇.

膜的過度曝光也是一個問題?—?但是它很容易解決.?你所要做的是將膜曝光的時間縮短.?同樣的，不充分的漂洗只是需要將沖洗更加充分徹底.?漂洗用來去掉過量的抗體.?當很多抗體存在印跡上時，很難將印跡和背景區(qū)分開來。改進的漂洗也可以通過使用更好的漂洗溶液來進行。

去除不充分的封閉

沒有正確的封閉,?免疫印跡的結(jié)果無法容易讀取.?不充分的封閉通常發(fā)生因為在孵育過程中的問題.?如果孵育的時間不足夠長，正確的區(qū)域不能得到封閉.?如果孵育的溫度不正確的話,封閉也不能完成.?也有化學試劑可以加入到這個過程中來進一步提高封閉.

保證封閉劑的兼容性

封閉劑,?如同在印跡實驗中使用的其他產(chǎn)品一樣，需要根據(jù)特定的應用進行調(diào)整.?使用錯誤的封閉劑很容易導致干擾和很差的難區(qū)分的印跡.?一些封閉劑基于血清蛋白的，而其他的是基于蛋白的。不同的抗體可以和封閉劑有潛在反應，所以有必要找到最合適的封閉劑.?無蛋白的封閉劑是良好封閉劑之一也是最容易的溶液.

降低抗體的濃度

通常高濃度的抗體會導致高的背景.?因為抗體濃度太高了，整個膜會被抗體所包被.?這會使得出決定性的結(jié)論很難.?當提到高濃度的抗體，只有很少一些解決方案可以解決?？贵w可進行恰當漂洗或更低濃度的抗體可以被使用.?膜或許也需要恰當?shù)奶幚?—?只要沒有過度干掉?—?它不會吸收很多的抗體溶液.

高背景也會發(fā)生當使用的化學試劑和耗材不合適或質(zhì)量很差.?在免疫印跡中高背景是經(jīng)常顯著發(fā)生的多種問題之一。.

其他需要考慮的因素之前已經(jīng)討論了就是轉(zhuǎn)印膜的選擇:?PVDF膜或硝酸纖維素膜 ?–?哪種膜最好?

一個經(jīng)常被忽視的問題是膜的效期.??在使用膜之前,?確保它沒有過期同時被正確儲存。

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