經(jīng)典的病原學(xué)檢測方法主要包括細菌（真菌）培養(yǎng)、鏡檢和抗體檢查，以及基于PCR的病原特異核酸檢測，這些方法在神經(jīng)感染性疾病診斷中取得了很大的進展，但在總體上其診斷靈敏度仍較低，時效性差，病原體鑒定信息和耐藥信息不全面，且對于未知或少見、罕見的病原微生物，無法進行識別。因此，臨床診斷神經(jīng)感染性疾病的難度很大。

在二十一世紀初，以多重PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)在感染性疾病病原學(xué)檢測中取得了很大的進步。美國的GeneXpert快速檢測系統(tǒng)和法國的Film?Array分子診斷系統(tǒng)均實現(xiàn)了感染性疾病責任病原的高通量檢測，但其一次最多只能檢測10余種病原微生物。目前已知可引起腦炎的病毒就超過100種，且病原體種類正在不斷增長，故目前的病原體檢測方法尚不能有效涵蓋臨床感染性疾病的病原譜。

二代測序技術(shù)（next?generation?sequencing，NGS）又稱為下一代測序技術(shù)和高通量測序，其可一次性對幾百萬到十億條DNA分子進行并行測序，是一組較一代測序通量更高、成本更低、用時更短且自動化程度更高的測序技術(shù)。因其可對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行深入、細致、全貌的分析，所以又被稱為深度測序。

從2010年開始，采用NGS檢測診斷感染性疾病開始逐漸從國家實驗室、疾控中心過渡到臨床。最早使用的NGS平臺為2005年發(fā)布的GS20測序儀，與之前基于Sanger測序原理的測序儀器相比，其獲得的微生物基因組數(shù)據(jù)量提高了百倍。從此之后，各家公司也分別推出了其各自的基于NGS的檢測儀器。

隨著NGS診斷神經(jīng)感染性疾病的研究越來越多，從2013年以前每年發(fā)表1-2篇研究報道，發(fā)展到2014年的6篇、2015年的13篇，目前NGS已經(jīng)成為臨床神經(jīng)感染性疾病診斷的有效工具之一。

神經(jīng)感染性疾病在臨床上主要表現(xiàn)為腦炎和腦膜炎，也可表現(xiàn)為腦膿腫（硬膜外、硬膜下、腦實質(zhì)）及腦肉芽腫等。神經(jīng)感染性疾病確診的依據(jù)在于從腦實質(zhì)或腦脊液內(nèi)檢測到病原生物的存在，而引起神經(jīng)感染的病原生物主要包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲、螺旋體、立克次氏體等。由于血腦屏障的存在，在血清內(nèi)難以檢測到有效的病原體信息，只有在腦脊液甚至腦實質(zhì)內(nèi)才能檢測到，而腦脊液取材相對困難、標本量小，均限制了神經(jīng)感染性疾病病原體的檢出。

近幾年來，由于新發(fā)病原體感染[重癥急性呼吸綜合征（severe?acute?respiratory?syndrome，SARS）病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒]的不斷涌現(xiàn)，耐藥細菌不斷出現(xiàn)，以及器官移植或免疫性疾病治療后各種條件致病菌的感染，感染性疾病再次回到臨床醫(yī)師的視野中。但感染性疾病的病原種類繁多，傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測及病原微生物培養(yǎng)等手段，在鑒定感染性疾病的病原方面耗時、費力，難以及時地為臨床提供可靠的診斷依據(jù)，使不少感染性疾病患者未能得到及時、有效的治療，導(dǎo)致其預(yù)后不良。

2014年，加州大學(xué)CharlesY.Chiu團隊在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》報道了世界第一例通過NGS檢測診斷的神經(jīng)感染病例。一位反復(fù)頭痛、發(fā)熱接近1年的患者，在進行了38種不同的診斷試驗（從血清學(xué)到培養(yǎng)和活檢），仍然無法明確其致病病原體，并進入了昏迷狀態(tài)，而最終使用NGS檢測明確其為鉤端螺旋體感染后，給予針對性的青霉素治療，最終患者轉(zhuǎn)危為安。

此后，多個高質(zhì)量的個案報道和臨床研究已經(jīng)表明，NGS有潛力成為神經(jīng)感染性疾病的診斷工具。對于并非臨床常見而沒有在多數(shù)醫(yī)院常規(guī)開展檢測的囊蟲、布氏桿菌、螺旋體等病原體，或者培養(yǎng)方法較復(fù)雜或非常規(guī)開展的李斯特菌、奴卡菌等病原體，NGS檢測可以規(guī)避常規(guī)檢查的不足。

總體上，目前估計有30%-60%的腦炎病例即使經(jīng)過全面深入的檢查，仍然無法明確其病因。使用NGS檢測可診斷病毒性（DNA病毒和RNA病毒）腦炎。使用DNAse可以通過降低人源化核酸的背景，從而顯著提高病原微生物的檢出率（30-50倍）。最關(guān)鍵的是，使用NGS檢測時，可以在完全沒有先驗信息或者臨床傾向性的時候檢測到病原，因此可對于少見、罕見感染或者新發(fā)的感染性病原體進行檢測。

除了這些已知感染人類的病原體以外，基于宏基因組的NGS檢測，還可識別一些此前未知的可以引起人類疾病的病原體。

如2015年，德國報道了3例基底節(jié)腦炎患者，通過NGS在腦內(nèi)檢測到松鼠博爾納病毒，患者臨床上以基底節(jié)病變?yōu)橹?，發(fā)病急驟，死亡率高，這是第一次發(fā)現(xiàn)松鼠博爾納病毒傳染人類的證據(jù)。

2015年，日本Sakiyama等報道了4例表現(xiàn)為腦脊髓膜炎的漁民，常規(guī)檢查包括活檢都未能明確其致病病原體，而通過NGS檢測發(fā)現(xiàn)其是感染了以前從未曾報道的屬于古細菌域的嗜鹽菌（Halobacterium），在給予復(fù)方磺胺甲惡唑治療后患者完全好轉(zhuǎn)。上述報道均表明，NGS檢測可以診斷出一些罕見的、新發(fā)的或者不典型的病原微生物，如鉤端螺旋體、星狀病毒、古細菌、博爾納病毒等，從而深化人們對神經(jīng)感染性疾病的認識。

2016年，西京醫(yī)院趙鋼教授團隊領(lǐng)銜獲得了科技部“組學(xué)特征譜在腦膜炎病原學(xué)診斷中的應(yīng)用”的重大專項研究成果，拉開了國內(nèi)NGS技術(shù)在神經(jīng)感染領(lǐng)域的使用。此后，協(xié)和醫(yī)院關(guān)鴻志教授和華大基因聯(lián)合進行了中樞神經(jīng)感染腦脊液NGS檢測的系列研究，已經(jīng)先后報道了皰疹病毒、李斯特菌、布氏桿菌等相關(guān)病原體引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。

2017年，復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院感染科張文宏教授團隊，應(yīng)用NGS技術(shù)在1例眼內(nèi)炎患者的玻璃體液中檢測到偽狂犬病毒（pseudorabies?virus，PRV），首次證實PRV可以感染人類，并引起眼內(nèi)炎。最近，由北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科關(guān)鴻志教授牽頭的多中心腦炎協(xié)作組，使用NGS技術(shù)在世界上首次報道了PRV導(dǎo)致人類腦炎的病例。我國在使用NGS診斷神經(jīng)感染的技術(shù)進展上基本與世界同步。

盡管腦脊液NGS檢測給神經(jīng)感染的病原學(xué)檢查帶來了很大變革，但目前NGS的檢測和解讀仍然存在著很多問題。不同于NGS檢測在遺傳性疾病中的應(yīng)用，感染性疾病待測標本的成分復(fù)雜、病原微生物核酸水平較低等因素均制約了腦脊液病原微生物的NGS檢測。

一、靈敏度有待提高

首先存在的問題是靈敏度，盡管NGS檢測在診斷少見、罕見病原體方面展現(xiàn)了優(yōu)于傳統(tǒng)方法的巨大實力，但對于常見的結(jié)核分枝桿菌、隱球菌等病原體，其靈敏度并不強于傳統(tǒng)方法。對于這些常見病原體，反倒經(jīng)常是傳統(tǒng)方法檢測不到，NGS檢測也查不到；而即使傳統(tǒng)方法檢測到這些病原體，NGS仍然可能檢測不到或只檢測到極少量特異的片段，難以確定其準確性。

例如對結(jié)核分枝桿菌的宏基因組檢測，目前最優(yōu)的方案仍然是在MGIT960液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上再進行NGS測序。究其原因，可能在于常見病原體的致病力較強，僅需少量病原體即可致病，而對少量病原體的檢測，NGS并不優(yōu)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)和PCR檢測。

另一方面，結(jié)核分枝桿菌可以是胞內(nèi)菌，而目前的檢測方法主要是用腦脊液上清進行檢測，就有可能漏掉胞內(nèi)感染的結(jié)核分枝桿菌；而結(jié)核分枝桿菌由于核酸中GC含量比較高（超高60%），多數(shù)細菌的解鏈方法不能充分將結(jié)核分枝桿菌的核酸鏈解開，因此在適合多數(shù)病原微生物的標本處理條件下，并不能有效地達到檢測結(jié)核分枝桿菌的效果。

故對部分抗酸染色或GeneXpert檢測結(jié)果陽性確診的結(jié)核性腦膜炎患者，NGS仍然只能在其腦脊液內(nèi)檢測到少量或根本沒有檢測到結(jié)核分枝桿菌的片段。目前對臨床標本直接進行NGS檢測來診斷結(jié)核分枝桿菌感染難度很大，而作為替代，往往是將臨床標本進行結(jié)核培養(yǎng)后再進行NGS檢測，以此提高臨床標本檢測的陽性率。

除了病原體的載量和特性的因素外，對于一些存在機體免疫反應(yīng)進而引起損害的感染性（后）腦炎，如乙型腦炎，主要依靠血清學(xué)檢查檢測患者體內(nèi)的乙型腦炎病毒抗體來診斷，即使最靈敏的RT-PCR檢測也只能在10%患者腦脊液內(nèi)檢出其核酸片段，故對于這些患者，NGS檢測的診斷意義有限，抗體檢測可能是其更為有效的臨床診斷方法。

因此，NGS雖然是高通量檢查，并理論上可以檢測幾乎所有病原微生物，但并不能完全替代臨床所有的病原體檢測方法。這要求我們一方面繼續(xù)優(yōu)化NGS的檢測方法，使其可以盡可能多地覆蓋病原體的范圍和提高檢出率，另一方面又要了解NGS技術(shù)的局限性，從而在進行NGS檢測的同時，要保留或探索其他有效的病原體檢測方法作為補充或驗證。

對于部分顱內(nèi)膿腫或肉芽腫患者，由于其病灶局限于腦實質(zhì)，釋放到腦脊液中的病原體含量有限，因此對于這些疾病，只有對組織標本進行NGS檢測才可能測得病原體。而腦組織與腦脊液在組成上差異很大，因此NGS檢測的樣品背景和組成都會影響到檢測結(jié)果。然而由于腦組織取材困難，目前對腦組織病原微生物的NGS檢測探索還比較少。

二、腦脊液NGS病原體檢測的診斷特異度較低

特異度較差是制約NGS臨床應(yīng)用的另一個主要問題，在NGS報告中經(jīng)?？梢钥吹讲恢虏〔≡w、不相關(guān)病原體、不明確病原體。與胃腸道、呼吸道不同，由于血腦屏障的存在，曾經(jīng)研究者認為腦內(nèi)不存在微生物，因此只要腦脊液內(nèi)檢測到細菌或病毒即意味著神經(jīng)系統(tǒng)感染的存在，對于既往的染色、培養(yǎng)等技術(shù)，這一原則均能成立。

但隨著NGS技術(shù)的出現(xiàn)，在腦脊液內(nèi)可檢測到很多不同物種的片段。標本里經(jīng)?？梢詸z測到多種無法解釋的病原微生物的特異讀長，其部分原因可能在于標本、試劑的污染，如環(huán)境微生物混雜其中（如植物、植物病毒等），難以判別。對于這些污染，需要通過實驗室質(zhì)控和標本間數(shù)據(jù)的比對進行排除。

因此，為了明確診斷，對于NGS檢測到的病原體信息往往需要使用傳統(tǒng)方法進行驗證，如關(guān)鴻志教授所診斷的PRV腦炎患者，均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)韓軍研究員團隊對標本進行血清學(xué)檢測予已確診。針對未來復(fù)雜的臨床樣本如血液、拭子、糞便等，數(shù)字PCR聯(lián)合NGS技術(shù)可以提高檢測目標序列的靈敏度，以協(xié)助感染性疾病診斷。

多個實驗室的報告也發(fā)現(xiàn)，腦脊液NGS測序中存在著一些較為常見的細菌成分，如丙酸痤瘡桿菌、伯克霍爾德菌和不動桿菌等。健康人或患者的腦組織和腦脊液內(nèi)是否會存在一個類似于低載量腸道菌群的微生物構(gòu)成，值得探索。

尤其是最近研究發(fā)現(xiàn)，在非神經(jīng)感染性疾病如阿爾茨海默病或肌萎縮側(cè)索硬化患者的腦脊液和腦實質(zhì)內(nèi)，可檢測到真菌、細菌或病毒的核酸片段和特異蛋白成分，提示病原微生物是神經(jīng)變性病潛在的觸發(fā)因素可能，但其臨床意義目前尚未完全明確，而其是否能成為最終的治療靶點還有待探索。借助于NGS技術(shù)，將可能重新認識病原微生物與神經(jīng)系統(tǒng)的相互作用模式和意義。

NGS技術(shù)在感染性疾病的診斷中具有極大的潛在價值，但也仍然有很大的局限性。目前已經(jīng)報道的NGS輔助診斷神經(jīng)感染的研究多為病例報道，多數(shù)情況下只能檢測到可疑的病原微生物特異讀長，即高通量測序時，讀出每一個片段的序列信息，而作為臨床診斷依據(jù)還缺乏明確的標準，往往還需要通過經(jīng)典病原學(xué)方法或臨床治療效果對其進行評估。因此，在臨床上使用NGS診斷神經(jīng)感染性疾病，需要在優(yōu)化NGS檢查方法的同時，繼續(xù)完善NGS的驗證和解讀。

一、NGS檢測結(jié)果的解讀——腦內(nèi)責任病原體的鑒定和微生物菌群的意義分析

NGS檢測診斷中樞神經(jīng)感染的核心是對責任病原體的識別。由于NGS檢測往往可以得到大量背景或者無關(guān)微生物片段，從中尋找或識別責任病原極為關(guān)鍵。目前常用的方法包括以下幾種。

1.?建立責任病原列表：對已報道的可致人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的細菌、真菌、病毒等微生物建立列表，一旦在NGS檢測中出現(xiàn)該致病病原體的片段，即認定為是致病病原體。這種方法對于致病性強或人類極少接觸的病原體，如布氏桿菌、鉤端螺旋體等病原體的診斷意義較大，而對于在機體中存在潛伏感染的病毒或者條件致病菌，因為不能區(qū)分其為現(xiàn)癥感染還是潛伏感染，而需要慎重判斷。

2.?建立腦脊液常見微生物數(shù)據(jù)庫：對于各實驗室、檢測單位在NGS檢測中常見的背景微生物建立數(shù)據(jù)庫，記錄其檢測到的常見片段數(shù)目。一旦在臨床標本NGS檢測中出現(xiàn)不屬于常見背景菌范圍的可疑病原體片段，或某種微生物的所檢片段數(shù)目明顯超過背景微生物數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，則將其列入可疑的責任病原體，并進一步用其他方法進行驗證。該策略尤其適合病毒感染引起的腦炎，如單純皰疹病毒感染患者腦脊液內(nèi)可以檢測到絕對和相對數(shù)量都極高的單純皰疹病毒片段。

3.?腦脊液微生物菌群的意義：腸道菌群對神經(jīng)系統(tǒng)的影響目前已得到廣泛認可，但腦內(nèi)是否存在著一個類似的微生物菌群，目前還存在爭議。目前的測序結(jié)果在檢測到可疑病原的同時，往往會檢測到很多“不相干”微生物的片段，傳統(tǒng)觀點認為其是系統(tǒng)污染或?qū)嶒炇椅廴緦?dǎo)致，而不予關(guān)注。但多個實驗室的報告也發(fā)現(xiàn)，存在著一些較為常見的細菌成分的組成，如丙酸痤瘡桿菌、根瘤菌等。

健康人或者患者的腦組織和腦脊液內(nèi)是否可能存在一個類似于腸道菌群的微生物構(gòu)成，值得探討。在非神經(jīng)感染性疾病如AD或ALS患者腦脊液和腦實質(zhì)內(nèi)可檢測到真菌、細菌或病毒的核酸片段和特異蛋白成分，但其臨床意義目前尚未完全明確。借助于NGS技術(shù)，可為探索神經(jīng)變性病和神經(jīng)感染的關(guān)系提供線索和依據(jù)。

二、NGS檢測結(jié)果的驗證——建立完整快速的神經(jīng)感染性疾病診斷體系

盡管NGS檢測在診斷神經(jīng)感染性疾病病原時經(jīng)常給出意想不到的病原體信息，但通常只有不到1/3的待檢標本可以檢測到明確的病原體信息。即使在腦脊液中通過NGS檢測到可能的責任細菌、真菌或病毒片段，其占總片段的比例也經(jīng)常極低，甚至只有數(shù)個片段，難以作為確診依據(jù)。因此，NGS檢測在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染診斷中往往只具有提示意義，而在檢測到非臨床常規(guī)篩查的病原體時，需要進一步使用經(jīng)典的病原體檢測方法進行確診。

如在非疫區(qū)，NGS檢測往往可以出人意料地檢出散發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)布氏桿菌染，而最終都必須通過布氏桿菌的抗體檢查予以驗證。這就需要在臨床上發(fā)展完善的病原體驗證檢測體系，尤其是對于一些常見方法不易檢測到的病原微生物，如奴卡菌和厭氧菌因為不易培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)陽性率極低，當NGS檢測有相關(guān)病原片段被查到時，可以有針對性地調(diào)整腦脊液培養(yǎng)的方案，以提高相關(guān)病原培養(yǎng)的陽性率。

由于目前的NGS檢測成本仍然較高，還不能在臨床廣泛普及，也影響到其時效性。因此，對于一些發(fā)病急驟、進展迅速的急性中樞神經(jīng)感染患者，需進一步發(fā)展即時的病原體檢測；而對于NGS檢測靈敏度較低的病原體，建立較為完備的診斷方法庫具有重要價值。

NGS也只是一種病原檢測方法，所以同樣存在其監(jiān)測的盲點和誤區(qū)，對NGS檢測結(jié)果不切實際的期待、依賴和解讀，不僅推高了臨床檢測成本，且使有效檢查無法順利開展，從而同樣帶來誤診和漏診。

因此，盡管Brown等建議將NGS作為腦炎病原學(xué)診斷的常規(guī)方法開展，但同時仍然要將單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒和腸道病毒等常見病毒的PCR檢測放在一線檢查行列。

三、NGS檢測方法的優(yōu)化——根據(jù)可能的責任病原體類型選擇最優(yōu)測序方案

目前臨床推出的NGS病原體檢測多數(shù)仍采用通用的標本處理和測序方案，其在未了解臨床具體病歷資料的情況下進行檢測，雖然方便了送檢流程，并降低了檢測成本，但由于不同標本和病原微生物（細菌、真菌、病毒、寄生蟲等）在測序時所需的最優(yōu)處理條件和生物信息分析不同，導(dǎo)致目前并不能讓一種NGS檢測流程適合于所有的感染性病原體。

這就需要在下一步的測序研究中，根據(jù)患者的病史和臨床檢查推測可能的病原體，有針對性地進行標本預(yù)處理后再測序，甚至對于測序結(jié)果的生信分析采用不同的策略，以期在適度兼顧各種未知病原體的同時，提高特殊病原體的檢出率。

除此之外，目前僅以檢測到的病原體Reads作為診斷依據(jù)的方法誤差較大，需要設(shè)定一定的標準和流程來確定檢測到的病原體是否為責任病原體，并根據(jù)不同類型病原體設(shè)計針對性的隨機雙盲試驗，來評估測序方法的有效性。

隨著測序技術(shù)的進展和成本的下降，NGS技術(shù)在臨床的應(yīng)用日益廣泛，美國食品藥品監(jiān)督管理局建議對特定的待檢樣本進行NGS檢測時，可以探索合適的步驟做成一個系統(tǒng)，從而最大程度地優(yōu)化責任病原微生物的檢出。

下一步，NGS技術(shù)的研發(fā)重點是如何對特定標本和可能病原體，在已有的檢測系統(tǒng)基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，從而提高責任病原體檢出的靈敏度和特異度。

此外，還應(yīng)重視的是，由于NGS檢測范圍和深度顯著超出傳統(tǒng)方法，因此對其檢測結(jié)果的評估與傳統(tǒng)微生物檢測方法的效果評估不同，需要發(fā)展新的NGS檢測特異度和靈敏度評估策略，才能為將來NGS檢測的應(yīng)用打下堅實基礎(chǔ)。

來源：診斷學(xué)理論與實踐??2018年7月第17卷第4期

作者：馮國棟?賀旻?汪昕（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）