【背景】
       CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的縮寫，中文全稱為“細胞因子誘導的殺傷細胞”。CIK是單個核細胞在CD3單抗和多種細胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3⁺CD56⁺細胞為主要效應細胞的異質(zhì)細胞群，其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞(自然殺傷細胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。CIK細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴增等特點，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細胞。

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【培養(yǎng)原理】
    CIK培養(yǎng)用細胞因子和抗體：

• CD3激發(fā)型單抗：

         T細胞活化的第一信號來自于T細胞表面的受體，即T細胞抗原受體(T cell antigen receptor, TCR)與APC提呈的
 抗原的特異性結(jié)合，也就是T細胞對抗原的特異性識別。TCR是由2條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，在T細胞表面，其與
 CD3分子通過非共價鍵結(jié)合，形成TCR/CD3復合體。TCR識別特異性抗原后會引起CD3和T細胞表面的輔助受體CD4
 或CD8分子的胞漿尾部聚集，進而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞漿的
 免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的
 酪氨酸(pY)進一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級聯(lián)反應(磷脂酰肌醇途徑或MAP激酶途徑等)，
 最終通過激活轉(zhuǎn)錄因子，使其進入細胞核內(nèi)，結(jié)合于調(diào)控T細胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的
 表達和轉(zhuǎn)錄，T細胞因而由靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)為增殖和活化狀態(tài)。 

        由上可見，CD3分子在T細胞活化信號的轉(zhuǎn)導中起著極其關鍵的作用。CD3激發(fā)型單抗與T細胞表面CD3分子特
  異性結(jié)合后，可引起CD3分子胞漿區(qū)ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進而導致T細胞增殖和活化的下游信號的激活，
  從而使T細胞增殖和活化。也就是說，CD3激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3復合物的識別和激活過程，從而引
   起T細胞的增殖與活化，因此是CIK細胞培養(yǎng)中不可或缺的刺激因素。
 
        此外，CD3激發(fā)型單抗在選用時一定要注意克隆號。研究表明，僅克隆號為OKT-3的CD3激發(fā)型單抗可以刺激
  所有人的T細胞的增殖，而其它克隆號的CD3激發(fā)型單抗僅能刺激一部分人的T細胞。因此，在進行CIK培養(yǎng)時，最
  好選用OKT-3克隆，以保證每個患者的T細胞均能被激活。

• IL-2 (白細胞介素-2)

         IL-2最初發(fā)現(xiàn)時被稱為T細胞生長因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T細胞增殖最重要的細胞因子。IL-2
  既是自分泌細胞因子，也是旁分泌細胞因子，其通過與T細胞表面的IL-2受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T細胞活
  化，并進入細胞分裂狀態(tài)。此外，IL-2還可刺激NK細胞的生長并增強其殺傷能力。因此CIK細胞培養(yǎng)中須添加IL-2，
  以促進T細胞的增殖與活化。

• IFN-g(干擾素–g)

         IFN-g具有上調(diào)外周血淋巴細胞表面IL-2R表達的作用，因此會增強T細胞對IL-2促增殖反應的敏感度和強度。在
 誘導CIK細胞形成的過程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-g加入的順序與CIK的細胞毒活性密切相
 關。先加入IFN-g，培養(yǎng)24后再加入IL-2，可明顯提高CIK的細胞毒活性。

•  IL-1-a (白細胞介素-1a) 　

         IL-1a也可以介導外周血淋巴細胞表面上調(diào)表達IL-2R。當IL-1a與IFN-g和激發(fā)型CD3單抗合用時，可以明顯提
 高CIK 的細胞毒作用。
 
【細胞制備】
1.  外周血單個核細胞的采集
     1.1    用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞50-100mL；
     1.2    淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)；
     1.3    無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。
 2.  CIK細胞的培養(yǎng)及鑒定
     2.1    將PBMC按1-2 x 10⁶/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1000 U/ml 的重組人IFN-g，37^oC，5%CO₂培
               養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
     2.2    24h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細胞的生長和增殖。
               注：此時也可同時加入100 U/ml的重組人IL-1a。
     2.3     每3天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2 300 U/ml；
     2.4     在培養(yǎng)的第14d，收獲CIK細胞。
     2.5     CIK細胞質(zhì)控：
           2.5.1     臺盼藍染色檢測：活細胞應在80%以上；
           2.5.2     流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達：CD3⁺CD56⁺細胞的比例應在20%以上。
           2.5.3     細胞殺傷實驗：以CIK細胞為效應細胞，以腫瘤細胞(可為原代腫瘤細胞或腫瘤細胞株)為靶細胞，將效
                         應細胞與靶細胞按10 : 1(數(shù)目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶細胞1 x 10⁴個，終體積為200
                         ml，設3個復孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測效應細胞對靶細胞的殺
                         傷率。
            2.5.4    收獲細胞前，取少量培養(yǎng)物進行細菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標準：病原學檢
                         測陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。 

【步驟簡圖】

 
【參考文獻】
         [1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II
              clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133