市場上的胎牛血清種類繁多,魚龍混雜,使人難以分辨真?zhèn)渭捌焚|(zhì)。并且為節(jié)節(jié)攀高的胎牛血清價格頭疼不已?還在為時不時斷貨而苦惱?還在糾結(jié)用澳洲產(chǎn)血清還是新西蘭源血清?如今,大部分實驗室都還在用胎牛血清或新生牛血清來培養(yǎng)細胞,但是隨著全球胎牛血清血源地減少以及胎牛血清價格的不斷上漲,以及來自動物保護組織的壓力,很多實驗室尤其是干細胞實驗室開始嘗試使用血清替代物來進行細胞培養(yǎng),這種趨勢從發(fā)達國家美國歐洲開始,他們的實驗室很多都已經(jīng)進行了很多年的血清替代物細胞培養(yǎng)。隨著亞洲尤其是中國科研經(jīng)費的充足以及干細胞研究的興起,國內(nèi)的無血清細胞培養(yǎng)也蔚然成風。
2005年首次報道人血小板裂解物(HPL)可以代替胎牛血清用于MSCs的大規(guī)模培養(yǎng)和制備,能滿足臨床應用的需求。
隨后有一系列的文章證明HPL能起到FBS的功能,促進MSCs的增殖擴增。這種高效的細胞增殖刺激使MSCs能夠在11-16天的單個培養(yǎng)周期內(nèi)進行大規(guī)模的臨床應用,而不需要進一步的傳代,同時保持基因組的穩(wěn)定性。
Ultroser G 血清替代品(Ultroser G serum substitute),是美國Pall公司專門針對生物治療、再生醫(yī)學、規(guī)模化哺動物細胞培養(yǎng)等過程中替代胎牛血清FBS研發(fā)而成,由Pall法國分公司生產(chǎn),原裝進口中國。
Ultroser G血清替代品具有25余年的應用歷史,自上市以來,受到歐洲和美國眾多科研人員的一致認可,在NCBI和ELSEVIER可搜索到近1000篇相關(guān)文獻。隨著全球胎牛血清價格的不斷上漲、干細胞研究的廣泛開展、以及國內(nèi)科研經(jīng)費的增加,越來越多的實驗室開始使用UltroserG 血清替代品進行細胞培養(yǎng)。
2.美國上市公司頗爾,國際生命科學領(lǐng)導品牌,20多年的產(chǎn)品應用歷史,得到美國和歐洲科學家的一致認可;
3.實驗結(jié)果已經(jīng)得到證明,在主流文獻數(shù)據(jù)庫中可以搜索到上千篇發(fā)表的文獻;
4.生物活性是血清的5倍;
5.干粉狀包裝,易儲存;
6.組分的一致性,批次的穩(wěn)定性,使實驗結(jié)果的可重復性提高;
7.恒定不變的生物活性;
8.更長的保質(zhì)期,從生產(chǎn)日期起4年;
9.兼容市場主流細胞培養(yǎng)基;
10.消除血清帶來的血紅蛋白,內(nèi)毒素,瘋牛病等潛在不穩(wěn)定因素影響;
PALL?15950-017血清替代品原瓶原裝進口中國。PALL血清替代品專門針對疫苗生產(chǎn)、抗體制備、細胞治療、規(guī)?;瘎游锛毎囵B(yǎng)研制而成,具有活性高、批次一致的核心優(yōu)勢。
PALL?15950-017血清替代品血清替代品屬于半固定成分,相對于動物制品的胎牛血清,具有多方面的產(chǎn)品優(yōu)勢:
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實驗方法:
實驗結(jié)果
CTS Dynabeads CD3/CD28磁珠不需要上游T細胞選擇,因為該技術(shù)基于CD3和CD28共表達同時分離和激活初始和早期記憶T細胞。流式細胞術(shù)分析顯示CD3+ CD28+ T細胞被分離,恢復率高(>90%)(圖2)。在激活后第3天,細胞被均勻刺激(>95% CD25+)并具有高純度(>95% CD3+)(圖3)。
(CTS Dynabeads CD3/CD28優(yōu)先分離CD3+ CD28+ 細胞。將PBMC與CTS Dynabeads CD3/CD28以3:1磁珠:細胞的比例孵育30分鐘,并分析陰性(非分離)級分并用于計算分離效率。A代表性細胞圖,證明CD3+ CD28+ T細胞分離的效率。B恢復實驗總結(jié)(n = 9)。)
(用CTS Dynabeads CD3/CD28分離的T細胞被均勻刺激且具有高純度。(A,B)在分析活化標記物之前,將分離的T細胞擴增3天。(C,D)在第0天(起始材料)和激活后第3天和第10天分析T細胞純度。)
(T細胞擴增后克隆多樣性增加。用CTS Dynabeads CD3/CD28分離并活化T細胞。(A)在第0,3和10天,收獲樣品用于TCRβ測序。(B)在一個實驗中,在激活后第3天也用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導T細胞。)
實驗結(jié)論
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Gibco? ? ? ? ? ? ? ? ? ??40203D? ? ? ? ? ? ??CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28
Gibco? ? ? ? ? ? ? ? ? ??11161D? ? ? ? ? ? ? ? Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation
BioGems? ? ? ? ? ? ? ? ?05121-25? ? ? ? ? ? ?Anti-Human CD3 SAFIRE Purified
]]>原理:對分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增,獲得高覆蓋率的完整的基因組后進行高通量測序,廣泛應用于癌癥研究、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細胞分化、免疫機制、微生物等方向的研究。
獲得高覆蓋度高保真性的全基因組擴增產(chǎn)物是準確全面的測序結(jié)果的保障。為了保證基因組高覆蓋度無偏好性的擴增,在單細胞測序技術(shù)誕生的近二十年時間里,全基因組擴增技術(shù)經(jīng)歷了幾次重大的變革。
WGA主要有三種方式:DOP-PCR,MDA,MALBAC。
下面小編就來為大家介紹一下WGA技術(shù)的演變歷程,以及怎樣根據(jù)實驗目的選擇相應的擴增方式。
DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction)
技術(shù)原理:簡并寡核苷酸引物PCR,引物的3′?含6bp的隨機序列,可以隨機的和基因組DNA結(jié)合,從而實現(xiàn)對全基因組的擴增。
應用范圍:因為PCR的指數(shù)擴增特性,放大了基因組上不同序列之間的差異,因而導致擴增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此,在1M bin size的水平上,DOP-PCR適合對染色體的CNV進行定量。
商品化試劑盒:Sigma-Aldrich, GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? MDA (Multiple Displacement Amplification)
技術(shù)原理:2001年由Laskin團隊發(fā)明,使用隨機的六聚體引物和φ29DNA聚合酶進行反應,該聚合酶具有很強的鏈置換特性,能夠在等溫的條件下,擴增產(chǎn)生50~100kb的核酸片段。同時由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對活性,φ29 DNA聚合酶具有很高的復制保真性。應用范圍:MDA法比DOP-PCR擁有更高的基因組覆蓋度,φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性,使得MDA法在對SNV的分析,以及構(gòu)建大片段文庫上有著顯著優(yōu)勢。但是,和DOP-PCR相同,MDA法依然是指數(shù)擴增,因此依然存在PCR反應的序列偏好性,然而,和DOP-PCR不同的是,這種偏好性并不能重復,因此MDA法不適合進行CNV的分析。
商品化試劑盒:Qiagen,?REPLI-g?Single?Cell?Kit。?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? MALBAC (Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles)
技術(shù)原理:2012年由謝曉亮團隊發(fā)明,擬線性的擴增過程降低了指數(shù)擴增的序列偏好性。擴增引物的5’含有27bp的共同序列,3’是8bp的隨機序列,可以和模板在15~20℃的低溫下結(jié)合,經(jīng)過8~12個循環(huán)的擬線性擴增后,再對這些環(huán)狀的擴增子進行指數(shù)擴增。應用范圍:MALBAC法的優(yōu)勢在于,雖然它依然存在一定的序列偏好性,但和MDA不同,MALBAC的這種偏好性在不同的細胞之間是可重復的,因此可以通過對參考細胞標準化后,進行CNV的分析;另外,由于其擴增的均一性,MALBAC法擴增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱點在于,它使用的聚合酶保真性不如φ29,因此MALBAC在檢測SNV時將會出現(xiàn)更多的假陽性;另外,由于它可重復性的序列偏好性,基因組上低擴增的區(qū)域有時會在擴增過程中丟失。
商品化試劑盒:Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit; Rubicon, PicoPLEX WGA Kit。
由上述的分析可見,MDA和MALBAC各有優(yōu)劣,實際上在不同的文獻中,研究者也會根據(jù)研究目的的不同,采取不同的方式對基因組進行擴增,以滿足研究的需要。
PicoPLEX??WGA Kit:用于單細胞文庫構(gòu)建的全基因組擴增解決方案
PicoPLEX??DNA-seq Kit:單細胞 DNA 文庫制備技術(shù),適用于 Illumina 所有 NGS 測序平臺
ThurPLEX??DNA-seq Kit:更高的通量, 更好的性能, 用于所有 Illumina 的 NGS 平臺
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Rubicon | R300381 | PicoPLEX DNA-seq Kit | 48 |
Rubicon | R300672 | SMARTer? PicoPLEX? Single Cell WGA Kit | 96 |
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全球和中國干細胞總體趨勢對比分析
隨著申請量的上升,授權(quán)量也 相應上升,但授權(quán)率近年來沒有太大波動,基本維持 在30%—40%之間細胞技術(shù)越來越受到重視,目前已進入快速生長期。此外,中國干細胞的授權(quán)率基本維持在40%—50%之間,高于全球10個百分點。
全球(左)和中國(右)專利技術(shù)
從圖中全球干細胞技術(shù)生命周期分析中可以看出,干細胞技術(shù)一直處于線性上升趨勢,平均斜率為2.7左右,說明干細胞技術(shù)現(xiàn)在仍處于發(fā)展階段,2001年之前的20年生長緩慢, 2001年之后的20年快速增長,這與全球干細胞總體趨勢一致。
全球干細胞申請量位居前二十位的國家/地區(qū),對干細胞的地域分布情況進行分析。
各國家/地區(qū)的申請來看,美國申請5 418件居首位,研究機構(gòu)及私人企業(yè)的重點研發(fā),使其成為全球干細胞的領(lǐng)導者;中國和世界知識產(chǎn)權(quán)組織緊隨其后,分別為4 843件和4 094件,中國政府近幾年加大了干細胞的研究投入,并將其納入“十三五”國家規(guī)劃和“健康中國2030”綱要;歐洲專利局、日本和韓國位列第三、第四和第五,日本的京都大學和韓國的首爾國立大學在干細胞技術(shù)研究上投入較大,并取得了豐碩的成果。
全球和中國干細胞主要競爭者
從全球近十年獲得干細胞發(fā)明專利授權(quán)的機構(gòu)中選取前十位,如圖。從機構(gòu)性質(zhì)上看,7家為科研院校,3家為上市公司;從國家分布上看,美國占7名,日本、韓國、中國各占1名??傮w來說,各機構(gòu)的授權(quán)量都呈上升趨勢。
總體來看,近十年全球和中國都重點關(guān)注間充質(zhì)干細胞和多能干細胞,包括臍帶間充質(zhì)干細胞、誘導多能干細胞等,不同點是全球還關(guān)注造血干細胞和干細胞制藥,中國關(guān)注神經(jīng)干細胞和腫瘤干細胞等。對比前五年(2008—2012年)與后五年(2013—2017年),全球關(guān)于核酸下降,生長因子和造血干細胞上升,中國關(guān)于多能干細胞和干細胞營養(yǎng)液下降,生長因子上升。
中國關(guān)注神經(jīng)干細胞和腫瘤干細胞,且近五年的研究重點增加了抗腫瘤藥和治療傷口、潰瘍、燒傷、疤痕、疙瘩等藥物,說明中國干細胞研究方向逐漸偏向抗腫瘤和創(chuàng)傷整形等方面。全球?qū)υ煅杉毎透杉毎扑幯芯枯^多,但中國在此方面相對較少,今后可加大該方面的研究。
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HY STEMCELL | HX0201M | CCGmHuMTM人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基,成分確定、無血清、無異源物 |
Corning | 88-600-CV | MSC xeno-free SFM |
Lifeline | LL-0062 | 骨髓MSC完全培養(yǎng)基套裝 |
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近日,某醫(yī)院有一老年病例,因吃炸醬面時不小心吸入了一粒肉醬后幾天開始發(fā)燒,咳嗽,呼吸困難入院,導致吸入性肺炎!后來經(jīng)過檢測治療發(fā)現(xiàn)為金黃色葡萄球菌肺炎,其痰培養(yǎng)示金黃色葡萄球菌證實吸入性金黃色葡萄球菌肺炎診斷??磥硎腔颊咴谶M食時吸入了一粒帶有金黃色葡萄球菌的肉醬,而引發(fā)的肺炎!
什么一粒肉醬竟會導致這么嚴重的后果?什么是金黃色葡萄球菌?
金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人類的一種重要病原菌,隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus),有”嗜肉菌”的別稱,是革蘭氏陽性菌的代表,可引起許多嚴重感染。而對于金黃色葡萄球菌在速凍食品中的存在量,衛(wèi)生部于2011年11月24日公布食品安全國家標準《速凍面米制品》,允許金葡菌限量存在。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種具有較強攻擊性的常見人類病原菌,隸屬于葡萄球菌屬,可引起多種醫(yī)院感染和社區(qū)感染性疾病,輕者引起化膿性皮膚感染,嚴重時甚至導致各種危及生命的并發(fā)癥,如菌血癥和心內(nèi)膜炎。金黃色葡萄球菌在環(huán)境中分布廣泛,對外界不利環(huán)境如干燥、低溫等有較強的抵抗能力,極易通過各種途徑污染食品,會引發(fā)金黃色葡萄球菌食物中毒(S.aureus food poisoning,SFP),對食品安全和人類健康造成重大威脅。當金黃色葡萄球菌污染食品后,會在適宜的環(huán)境條件下大量繁殖,與此同時分泌各種毒素或毒力因子,如金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins,SE),大大增加了其侵襲性和致病力。
根據(jù)美國疾病預防控制中心的研究報道,每年在美國由金黃色葡萄球菌導致的食物中毒約有24萬人次,其中1000多人需要住院治療并約10人因此死亡,由該菌引起的食物中毒占整個細菌性食物中毒的33%;在加拿大,這個比例高達45%同。我國每年也會發(fā)生多起該類食品安全事件,給醫(yī)療衛(wèi)生造成巨大壓力。
金黃色葡萄球菌感染危害
當身體被金黃色葡萄球菌感染的時候,體內(nèi)的白細胞會有所下降,從而導致機體的抵抗力下降,增加患病的風險。
當天氣炎熱的時候,食物易發(fā)生變質(zhì),產(chǎn)生大量的金黃色葡萄球菌,從而引起金黃色葡萄球菌感染癥狀,導致出現(xiàn)食物中毒的現(xiàn)象,引起機體產(chǎn)生一些惡心、嘔吐、頭暈等食物中毒反應,嚴重的可能會出現(xiàn)暈厥的現(xiàn)象。
金黃色葡萄球菌對皮膚也會造成傷害,引起皮膚出現(xiàn)潰爛化膿的現(xiàn)象,如果傷口處被金黃色葡萄球菌感染,會使傷口擴散,加重病情,延長傷口的愈合時間,身體出現(xiàn)嚴重的炎癥反應,引起發(fā)熱,惡心等現(xiàn)象。如果血液中含有金黃色葡萄球菌,經(jīng)過大腦后,嚴重會引起腦膜炎,輕者出現(xiàn)頭痛、發(fā)熱、惡心嘔吐等不適癥狀,重者還會出現(xiàn)休克的現(xiàn)象,需要立即搶救才可以。
另外,金黃色葡萄球菌感染后還可能會出現(xiàn)其它方面的疾病,比如引起腸炎、肺炎、心內(nèi)膜炎等,還可能會引起中毒性的休克、敗血癥等嚴重后果,因此,大家日常需要注意做好個人的衛(wèi)生工作,勤加鍛煉,提高身體的免疫力和抵抗能力。
相關(guān)事件
北京市工商局2011年10月19日查出思念牌的三鮮水餃含有金黃色葡萄球菌。
新快報2011年11月4日報道,廣州市工商局公布2011年第三季度三類食品質(zhì)量檢驗結(jié)果,“三全”以及“海霸王”的三款速凍食品也都被驗出含有金黃色葡萄球菌,分別是“三全灌湯水餃(豬肉玉米蔬菜)”、“三全灌湯水餃(三鮮)”以及“海霸王經(jīng)典包心魚丸”。
2012年1月,媒體報道,爺爺因親吻三代單傳的孫子致其感染金黃色葡萄球菌而得敗血癥,最終不治死亡。
控制方法
金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測主要有動物試驗、血清學試驗、免疫熒光試驗及酶聯(lián)免疫吸附等方法。
防止帶菌人群對各種食物的污染,需要定期對生產(chǎn)加工人員進行健康檢查,患局部化膿性感染(如疥瘡、手指化膿等)、上呼吸道感染(如鼻竇炎、化膿性肺炎、口腔疾病等)的人員要暫時停止其工作或調(diào)換崗位。
防止金黃色葡萄球菌對奶及其制品的污染,牛奶廠要定期檢查奶牛的乳房,不能擠用患化膿性乳腺炎乳牛的牛奶;奶擠出后,要迅速冷至-10℃以下,以防毒素生成、細菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶為原料,注意低溫保存。對肉制品加工廠,患局部化膿感染的禽、畜尸體應除去病變部位,經(jīng)高溫或其他適當方式處理后進行加工生產(chǎn)。
防止金黃色葡萄球菌腸毒素的生成,應在低溫和通風良好的條件下貯藏食物,以防腸毒素形成;在氣溫高的春夏季,食物置冷藏或通風陰涼地方也不應超過6h,并且食用前要徹底加熱。
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]]>2019年底突如其來的新型冠狀病毒,讓我們再次認識到了廣泛分布且種類繁多的病原微生物對人類的威脅。面對一場突如其來的疫情,既要采用科學的手段快速發(fā)現(xiàn)并認識病原微生物,同時也要基于科學的認識制定可行的臨床檢測和治療方案。新興的高通量基因測序技術(shù)通過直接對病毒基因組進行全面分析,對于2019-nCoV的首先確認、動態(tài)分析、進化來源以及致病機制、傳播途徑研究等具備了無可比擬的優(yōu)勢。
作為分子生物學領(lǐng)域的行業(yè)領(lǐng)導者,QIAGEN旗下多款經(jīng)典病毒核酸純化試劑盒就以其回收率高、核酸純度高、多樣本兼容性的優(yōu)勢在2019-nCoV實驗檢測環(huán)節(jié)中 做好準備。同時QIAGEN提供了基于不同技術(shù)和方法的檢測方案,包括高通量測序技術(shù)方案。
除了新型冠狀病毒外,近年來造成人類感染的病原微生物也日益復雜,同時抗菌藥物濫用與細菌耐藥已成為全球關(guān)注的焦點。如今,高通量測序已經(jīng)迅速成為臨床實驗室的重要檢測平臺,延展并提高了經(jīng)典微生物方法的檢測能力,
病毒核酸全轉(zhuǎn)錄組擴增
實際的檢測過程中可能拿到的并非都是最佳樣本,如來自上呼吸道的咽拭子就因其自身病毒含量低而極易造成檢測假陰性。面對這樣的現(xiàn)實困境,我們在提高核酸產(chǎn)量、質(zhì)量的同時,也可以借助 “全轉(zhuǎn)錄組擴增技(WTA)”技術(shù)對核酸進行均等的放大,解決樣本量不足的難題。
基于QIAGEN充分優(yōu)化改良的 “多重置換擴增(MDA)”技術(shù),REPLI-g WTA Single Cell能夠針對單個細胞或pg級純化RNA進行快速的全轉(zhuǎn)錄組擴增。區(qū)別于傳統(tǒng)PCR類擴增方法,REPLI-g可在等溫條件下進行均等、高保真的高靈敏度擴增,雙鏈cDNA產(chǎn)物非常適用于下游進行高通量測序(二代或三代測序)、PCR等方法檢測,也多次被運用于類似疫情的檢測方案中,如在2014年西非埃博拉病毒以及2016年中國南方的寨卡病毒疫情方案中,來自中國疾控中心、廣東省疾控中心等單位的研究人員就已將REPLI-g應用在對抗疫情的實戰(zhàn)中。
人源等宿主rRNA去除
疫情檢測所采用的樣本絕大多數(shù)來自呼吸道、血液等,純化后的核酸產(chǎn)物中還存在著大量的人源RNA,占用大量數(shù)據(jù)的同時還會對結(jié)果的準確性產(chǎn)生潛在影響。通過對測序的結(jié)果進行分析,我們可看到人源rRNA序列占比極高,因此我們可以通過去除人源rRNA等手段來部分解決這一問題。此時,又到了QIAseq FastSelect展現(xiàn)其真正實力的時候了!
借助獨特的“黑科技”,僅需通過簡單的1步加樣以及一段程序性降溫孵育,無需任何純化步驟,便能在14分鐘內(nèi)完成樣品中人源或其他哺乳動物來源rRNA的高效去除。這一過程可與REPLI-g WTA Single Cell Kit以及幾乎所有其他的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA建庫試劑盒相兼容,在避免因多步純化而造成病毒核酸損失的同時,還可極為快速地完成rRNA去除這一限速步驟。此外,如果在糞便、肛拭子等樣本中存在較多的細菌組分,我們也同樣可以利用QIAseq FastSelect 5S/16S/23S Kit結(jié)合QIAseq FastSelect HMR Kit在一步流程中同時完成全部細菌和宿主rRNA的去除,十分便捷。
產(chǎn)品名稱 ?????????貨號
QIAseq FastSelect -rRNA & -Globin HMR Kit???334386
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在完成rRNA去除并對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(含二鏈合成)后,一款高效的建庫試劑盒是完成cDNA樣品文庫構(gòu)建的測序前關(guān)鍵步驟。KAPA?KK8514 DNA HyperPlus文庫構(gòu)建試劑盒
貨號:KK8514,整合了DNA酶切片段化及文庫構(gòu)建步驟,所有反應均在一管中完成。酶切片段化可以降低DNA末端損傷,尤其對于FFPE DNA更是如此。
貨號 產(chǎn)品名稱 規(guī)格
KK8514 KAPA DNA HyperPlus?文庫構(gòu)建試劑盒,含擴增 96?次
KK8512 KAPA DNA HyperPlus?文庫構(gòu)建試劑盒,含擴增 24次
KK8513 KAPA DNA HyperPlus?文庫構(gòu)建試劑盒,PCR-Free 24?次
KK8515 KAPA DNA HyperPlus?文庫構(gòu)建試劑盒,PCR-Free 96?次
過去幾周來自中國疾控等單位的科學家在其研究中也分別采用了QIAGEN樣本制備(QIAamp Viral RNA Mini Kit,貨號:52904)等解決方案進行了冠狀病毒的測序和基因組分析并相繼發(fā)表在國際頂尖雜志上。
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CIK細胞中的效應細胞CD3+CD56+細胞在正常人外周血中極其罕見,僅1%~5%,在體外經(jīng)多因子培養(yǎng)28~30天,CD3+CD56+細胞迅速增多,較培養(yǎng)前升幅可達1000倍以上。實驗證明,擴增出的CD3+CD56+細胞來源于外周血中的CD3+CD56-T細胞和CD4-CD8+T細胞,而非CD3-CD56+NK細胞。比較CD3+CD56+CIK細胞中表達CD8+和CD8-的兩群細胞其殺瘤活性沒有顯著性差異,提示CIK細胞的細胞毒性與CD3CD56表達成相關(guān)趨勢,而與CD8的表達未表現(xiàn)出相關(guān)性。
CIK細胞治療殺傷原理
??? CIK細胞能夠通過三種途徑殺滅腫瘤細胞和病毒感染細胞:
CIK細胞對腫瘤細胞和病毒感染細胞的直接殺傷:CIK細胞可以通過不同的機制識別腫瘤細胞,釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒,導致腫瘤細胞裂解。
CIK細胞釋放的大量炎性細胞因子具有抑瘤殺瘤活性:體外培養(yǎng)的CIK細胞可以分泌多種細胞因子,如IFN-γ、TNF-α、IL-2等,不僅對腫瘤細胞有直接抑制作用,還可通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)反應間接殺傷腫瘤細胞。
CIK細胞能夠誘導腫瘤細胞的凋亡:CIK細胞在培養(yǎng)過程中表達FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)通過與腫瘤細胞膜表達的Fas(Ⅰ型跨膜糖蛋白)結(jié)合,誘導腫瘤細胞凋亡。
CIK細胞治療殺瘤特點
1.?增殖速度快?
CIK細胞在培養(yǎng)過程中加入多種細胞因子后,細胞增殖速度迅速加快,在培養(yǎng)第22天增殖曲線達頂峰,其中CD3+CD56+細胞不僅數(shù)量增加1000倍以上,且所占百分比也大幅上升,培養(yǎng)至28~30天時達平臺期,細胞毒活性亦達峰值。
2.殺瘤活性高?
CIK細胞是以CD3+CD56+T細胞為主的異質(zhì)細胞群,大量體內(nèi)外實驗證實CIK細胞較以NK細胞為主的LAK細胞具備更強大的殺瘤活性,而且其體內(nèi)殺瘤細胞毒性的維持不必依賴大劑量外源性IL-2的持續(xù)給予。體外實驗表明CIK細胞殺傷效率更高。
3.殺瘤譜廣?
CIK細胞因沒有T淋巴細胞殺傷時的MHC限制性,故對于多種腫瘤細胞系(包括K562、Hela、HL60、OCRF-CEM等)和新鮮腫瘤組織均表現(xiàn)出強大的殺傷活性。
4.?對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感
CIK細胞對化療藥物敏感的親本細胞和不敏感的轉(zhuǎn)化細胞均具有強大的殺傷活性,兩者比較無差別。
5.?殺瘤活性不受CsA、FK506等免疫抑制劑的影響
Mehta觀察到免疫抑制劑CsA和FK506雖然可以抑制抗CD3單抗介導的CIK細胞脫顆粒過程,卻不影響靶細胞誘導的CIK細胞脫顆粒,并且CIK細胞對靶細胞的殺傷活性不會因此降低
6.?對正常骨髓造血前體細胞毒性很小
實驗證實CIK細胞對正常髓系克隆生成幾乎沒有影響。
7.?能抵抗腫瘤細胞引發(fā)的效應細胞Fas-FasL凋亡
CIK細胞治療適應癥
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CIK細胞治療屬于過繼細胞免疫療法,由于CIK細胞溶瘤作用是非MHC限制性的,即不受腫瘤組織類型的限制,因此對任何一種腫瘤均有殺傷作用,但對高抗原表達的癌癥療效最好,如:髓性白血病、黑色素瘤、腎細胞癌、轉(zhuǎn)移性腎癌、非何杰金氏淋巴瘤等。其它癌癥如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、大腸癌等,CIK細胞治療亦有較好的療效。CIK細胞治療適用于任何一期的癌癥患者,但對早期腫瘤患者或經(jīng)過手術(shù)及放化療后腫瘤負荷較小的患者效果好。它對于手術(shù)、放化療或造血干細胞移植后患者體內(nèi)微小殘留病灶的清除,防止癌細胞擴散和復發(fā),提高患者自身免疫力,減少毒性反應等方面具有重要作用。某些不適合手術(shù)、不能耐受放化療的中晚期腫瘤患者,CIK細胞治療可以提高其生活質(zhì)量,延長帶瘤生存時間。
CIK細胞治療有效期
CIK細胞通過直接殺傷、分泌多種細胞因子等直接抑制腫瘤細胞生長,誘導腫瘤細胞凋亡等途徑起到治療作用。大多數(shù)執(zhí)行殺傷功能的細胞在回輸后立即執(zhí)行其功能,半衰期約2周至一個月?;剌?shù)募毎邪ㄒ徊糠钟洃浖毎纱婊顜啄曛翈资?,當遇到相應刺激后,迅速在體內(nèi)活化,殺傷靶細胞。所以CIK細胞治療的療程間隔原則上為一個月,建議首先間隔一個月連續(xù)做三個療程,以后每半年做一個療程。
CIK細胞治療應用廣泛,推薦給大家Peprotech一些好用的鑒定產(chǎn)品:
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06121-20?Anti-Human CD4 Purified
84421-20?Anti-Human TNF-alpha Purified
96-200-02 Human IL-2
900-k21 ?Human IL-10 ELISA? Kit
900-k96 ??Human IL-12 ELISA Kit
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??? 自然殺傷細胞(NK cell, Natural killer cell)是一種細胞質(zhì)中具有大顆粒的細?胞,也稱NK細胞,由骨髓細胞發(fā)育而成。因為其非專一性的細胞毒殺作用而被命名。NK細胞主要分布于外周血中,占外周血單核細胞(PBMC)的5%~10%,淋巴結(jié)和骨髓中也存在NK細胞,水平較外周血低,但它可以消滅許多種病源體及多種腫瘤細胞。自然殺傷細胞會直接和陌生細胞接觸,并以細胞膜?破裂之方式殺死此細胞,可利用分泌穿孔素及腫瘤壞死因子,摧毀目標細胞。目前研究認為NK細胞特異性表達CD56,而缺乏T細胞抗原CD3。一般認為在PBMC中分選到CD3- / CD56+的細胞即為NK細胞。
??? NK細胞屬于粒狀淋巴細胞,是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,也是機體抗御感染和防止細胞惡性轉(zhuǎn)化的重要免疫調(diào)節(jié)細胞。它對靶細胞殺傷時既不需特異性抗體參加,也不需抗原預先致敏。卻能立即發(fā)揮非特異性殺傷靶細胞的作用,尤其是對多種腫瘤細胞有迅速殺傷和溶解作用。因此,NK細胞對癌癥的監(jiān)視作用和抵抗功能已越來越受到重視。
NK細胞的活化
??? NK細胞可通過多種途徑被活化,包括細胞膜表面的CD2、CD3分子和多種細胞因子。
????1.?通過CD3分子的ζ鏈
??? NK細胞不表達TCR/CD3復合物,但部分NK細胞表達CD3ζ鏈,當用CD16抗體刺激NK細胞活化時,ζ鏈發(fā)生酪氨酸磷酸化,引起胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高,IP3水平增加,促進細胞因子合成和ADCC作用。
????2.?通過CD2分子
??? CD2與CD58相互作用或用CD2 McAb刺激可活化NK細胞,CD3 ζ鏈發(fā)生酪氨酸磷酸化。
????3.?自然殺傷細胞刺激因子
??? 自然殺傷細胞刺激因子(natural killer cell stimulatory factor, NKSF)對NK細胞有刺激作用。IL-2、IL-12、IFN-α、TNF-α以及白細胞調(diào)節(jié)素(leukoregulin, LR)?對NK細胞的活化和分化有正調(diào)節(jié)作用,?體外培養(yǎng)時加入上述細胞因子可明顯提高NK的殺傷活性。
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NK細胞的功能
??? 1. 自然殺傷活性,NK細胞的殺傷活性無MHC限制,不依賴抗體,可以直接通過分泌釋放穿孔素、顆粒酶、NK細胞毒性因子、TNF-α和TNF-β等對病毒感染的細胞、白血病細胞以及其他腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒活性,從而殺傷或者裂解靶細胞;
2. 抗病毒感染,NK可選擇性地殺傷病毒感染的靶細胞。由輔佐細胞或NK細胞所產(chǎn)生的IFN可協(xié)同NK的抗病毒作用,而對正常細胞有保護作用。另一方面,病毒感染細胞表面的病毒抗原和其它表面分子使得其對NK細胞的殺傷作用變得更加敏感。此外,NK細胞在體外還可殺傷某些細菌、真菌、原蟲等,可能與NK細胞釋放某些殺傷介質(zhì)有關(guān)。
3. NK細胞在免疫監(jiān)視、殺傷突變的腫瘤細胞可能比T細胞具有更重要的作用。某些疾病如Chediak-Higashi或X性聯(lián)淋巴增殖綜合征患者,由于NK功能缺陷對惡性淋巴細胞增殖疾病特別易感。
4. 參與骨髓移植后移植物抗白血病效應:在體外NK細胞可殺傷某些淋巴樣和髓樣白血病細胞。骨髓移植后數(shù)周內(nèi),來自供體的NK細胞在PBL中占相當高的比例。此外,在體內(nèi)NK細胞還可殺傷某些不成熟細胞如骨髓干細胞、胸腺細胞亞群等。
NK細胞治療方法
????治療流程:
確定患者的入選標準→相關(guān)檢查→血液采集→分離外周血單個核細胞→培養(yǎng)NK細胞→獲得NK細胞→細胞回輸→療效評估→隨訪
培養(yǎng)方法:
1、治療前檢查血常規(guī)、凝血功能等常規(guī)項目;
2、用血液分離機采集病人外周血淋巴細胞或直接采集外周血;
3、在GMP實驗室里,從采集的外周血中分離出單個核細胞,經(jīng)多種細胞因子誘導、激活后進行增殖培養(yǎng),此過程需要9-12天。
4、于培養(yǎng)的第9-13天開始分次回輸NK細胞,每次回輸過程大概1.5個小時。
5、一個療程約14-16天。此后視情況進行下一療程治療。
NK細胞治療特點
??? 1、可直接識別、殺死癌細胞,抑制腫瘤的生長及擴散;
2、可直接改善和調(diào)節(jié)患者的免疫力和神經(jīng)系統(tǒng);
3、通過其分泌的因子抑制腫瘤附近新血管的增生,限制腫瘤生長;
4、分泌多種細胞因子,減少患者疼痛,提高生活品質(zhì);
5、NK細胞療法可用于多種癌癥,尤其對血液腫瘤,肺癌、淋巴癌、食道癌、乳癌、肝癌等血流旺盛且血管較密集的腫瘤有很好的療效。
上一期介紹了一些免疫細胞治療經(jīng)典產(chǎn)品,今天同樣給大家推薦一些好用的產(chǎn)品,不要錯過哦!
品牌 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
PALL | AP-4951 | Acrodisc??白細胞針頭過濾器,10/pkg |
PALL | AP-4952 | Acrodisc??白細胞針頭過濾器,50/pkg |
Peprotech | 900-k25 | Human TNF-α ?ELISA ?Kit |
Peprotech | 96-200-21 | Human IL-21 |
Peprotech | 96-200-02 | Human IL-2 |
Peprotech | 96-200-15 | Human IL-15 |
Peprotech | 05111-80 | human CD3 |
Peprotech | 06111-60 | humanCD4 |
BD | 555332 | human CD3/FITC |
BD | 557710 | human CD16 ALEXA 647 |
BD | 555516 | humanCD56/PE |
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頗爾實驗室還真的推出了這樣一種工具——Acrodisc WBC?(白細胞收集)無菌針頭濾器。這是一種新穎的過濾裝置,專為捕獲和收集白細胞以及分離紅細胞而設計。它包含了頗爾公司專利的Leukosorb膜材質(zhì)。這種纖維狀的膜材質(zhì)可以特異性的來捕獲和收集白細胞,同時讓紅細胞和血小板流出膜。
操作過程十分簡單。您只需通過標準的魯爾接口將血液樣本注入Acrodisc WBC針頭濾器,同時在收集管中捕獲任何殘留的樣本。一旦樣本被完全注入,使用適當?shù)闹Ъ茏寴颖局绷ⅲ员阍谥亓ψ饔孟峦ㄟ^Leukosorb膜,捕獲和收集白細胞,并讓紅細胞和血小板通過濾膜進入收集管。整個操作過程只需要10-15分鐘。之后可利用分離介質(zhì)通過濾器反轉(zhuǎn)的方式從濾膜上用PBS洗脫捕獲的白細胞進行進一步的培養(yǎng)。
操作簡單固然重要,但大家更感興趣的是效果如何。與白膜層密度梯度離心的方法相比,Acrodisc WBC無菌針頭濾器這個小小的工具就完成了所有看似困難的工作,不需要反復離心,也不必擔心樣本丟失,效率更高。濾器能從全血樣本中去除大于99%的白細胞,同時從樣本中更多地富集紅細胞。紅細胞可以用于一系列細胞和抗原分析,而白細胞也可以用于進一步的免疫和基因表達研究,其中60%的白細胞可以得到回收,繼續(xù)培養(yǎng)的白細胞存活率高為80%。
Acrodisc WBC無菌針頭濾器的有效過濾面積(EFA)為3.9 cm2。與更大的濾器產(chǎn)品相比,它可以得到更高的細胞捕獲和回收效率,同時需要更少的樣本。而與大的白細胞分離濾器相比,它的死體積非常低。在樣本總體積為12 mL時,死體積不到2 mL。這也意味著您需要更少的樣本,同時頗爾實驗室貼心的提供10個的小包裝,相當于又省了一筆。
這種高端的針頭濾器已經(jīng)在實驗室中得到驗證。通過使用Acrodisc WBC白細胞收集無菌針頭濾器可以有效地截留白細胞。
阻凝劑相容性
用以下阻凝劑測試過濾器:
●K2EDTA
●肝素鋰
●檸檬酸鈉
應用
●?抗原特異性和調(diào)控研究
●?聚蔗糖試劑分離
●?細胞療法中的淋巴細胞回收
●?單克隆抗體開發(fā)
●?干細胞研究應用
●?受體蛋白研究
●?基因分型、基因表達
如果您使用Ficoll方法效果不佳,或者厭倦了繁瑣的操作,不妨來試試Acrodisc WBC白細胞收集無菌針頭濾器。
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?此前湖北省針對新型冠狀病毒肺炎治療使用恢復期血漿,恢復期血漿治療的原理是什么?療效如何?會對疫情的發(fā)展產(chǎn)血漿治療是什么,效果怎么樣生怎樣的影響?
血漿治療的原理:被動免疫
血漿治療的原理,我們需要引出一個概念:人工免疫,即根據(jù)自然免疫的原理,通過人工的方法使人體獲得特異性免疫,可分為主動免疫(active immunity)和被動免疫(passive immunity)。
主動免疫,將疫苗或類毒素接種于人體,使機體產(chǎn)生獲得性免疫力的一種防治微生物感染的措施,主要用于疾病的預防,疫苗就是一個主動免疫的典型案列。
被動免疫,機體被動接受抗體、致敏淋巴細胞或其產(chǎn)物所獲得的特異性免疫能力。相較主動免疫,被動免疫的特點是效應快,一經(jīng)輸入,立即可獲得免疫力,但維持時間短,主要用于疾病的治療或緊急預防。
這次新冠肺炎中提到的恢復期血漿治療,就屬于人工免疫中的被動免疫范疇。
經(jīng)歷細菌或病毒性感染而幸存的患者,體內(nèi)已經(jīng)對特異的病原體產(chǎn)生體液免疫,血液中通常含有高滴度的特異性抗體,而輸注恢復期血制品(convalescent blood products,CBP) 的患者可因此獲得被動免疫,中和特異性病原體,最終清除血液循環(huán)中的病原體。
武漢金銀潭醫(yī)院院長張定宇也在新聞發(fā)布會上表示:“(新冠肺炎)康復患者體內(nèi)有大量的中和抗體對抗病毒?!?/p>
血漿治療的歷史背景
事實上,血漿治療并非首次出現(xiàn),被動免疫預防和治療人類傳染病可以追溯到?19 世紀。
當時人們還沒有發(fā)現(xiàn)抗生素,通過從被感染的動物(特別是馬、兔子)的血漿中尋找特異性抗體并對相應人群進行注射,短期免疫化以對抗感染病原體。
此外,1918~1920 年的西班牙流感、1920~1940 年代的猩紅熱、1970 年代的百日咳流行期間,由于當時缺乏治療相應疾病的特效藥,恢復期血制品都發(fā)揮了重要的作用。
目前,恢復期血制品治療主要用于沒有可用疫苗、沒有特異性治療的新出現(xiàn)急性嚴重病毒感染,如?SARS、Ebola、MERS(中東呼吸綜合征)等。
療效參考:恢復期血漿治療?SARS 感染相關(guān)研究
1 月 27 日,國家衛(wèi)健委辦公廳發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第四版)》首次提出,重型、危重型病例有條件情況下可考慮恢復期血漿治療。
在衛(wèi)健委后續(xù)更新的第五版診療方案中,同樣延續(xù)了這一治療方案。
該療法臨床效果如何?
據(jù)相關(guān)報道,2 月 8 日,武漢市江夏區(qū)第一人民醫(yī)院首期開展了對 3 名危重患者的新冠特免血漿治療,目前累計治療危重病人超過 10 人。臨床數(shù)據(jù)表明,患者接受治療 12~24 小時后,實驗室檢測主要炎癥指標明顯下降,淋巴細胞比例上升,血氧飽和度、病毒載量等指標,臨床體征和癥狀改善。
由于目前通過這一療法治愈患者數(shù)量仍然相當有限,其療效仍舊缺乏足夠的臨床證據(jù)。
大部分新冠肺炎屬于自限性疾病,以對癥支持治療為主,以平穩(wěn)度過急性期;而且恢復期血漿治療屬于輸血治療,可能存在輸血反應,如發(fā)熱、過敏、溶血反應、循環(huán)負荷過重、輸血傳播疾病等風險。
因此,恢復期血漿主要還是用于個別危重癥患者的挽救性治療。
目前,由于難以在短期內(nèi)發(fā)明與量產(chǎn)人工合成的特異性抗體,我們只能從恢復期患者身上采集血漿以利用其中的人源性抗體。
全國累計治愈新冠肺炎患者大于患病者,不可能所有的康復患者都愿意獻血且符合獻血標準,恢復期血漿仍是非常稀缺的醫(yī)療資源。如果沒有充足的恢復期血漿,這一療法可能只能停留在試驗階段。
血漿使用是有標準的,只要符合標準就可以臨床上使用。從救治危重癥患者來看,應該及早使用看看效果?!?/p>
此外,雖然目前小樣本臨床試驗發(fā)現(xiàn)對危重新冠肺炎有效,但根據(jù)已有的?SARS 研究,恢復期血漿治療可能只能降低 7~23% 的死亡率,效果可能不一定十分顯著。
血漿治療仍然存在著一些不確定的潛在風險。該療法對部分重癥患者可能會有幫助,但大規(guī)模應用還缺乏必要的基礎研究依據(jù)。此外,考慮到重癥患者本身就存在著營養(yǎng)和免疫失調(diào),即使輸入正常未感染者血漿也會有改善癥狀的作用,仍需要看對照組的結(jié)果。
而從倫理學角度來看,恢復期患者獻血對自身免疫和疾病康復有無風險?這個還需要我們進行研究,但這些給我們治療新冠提供新的思路,華雅思創(chuàng)生物作為生物試劑行業(yè)內(nèi)的一員,愿推出高品質(zhì)、高穩(wěn)定性、高性價比的產(chǎn)品,為戰(zhàn)勝疫情貢獻綿薄之力。
品牌 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
Peprotech | BGK05231 | Human IL-6 Pre-Coated ELISA Kit |
PALL | AP-4951 | 白細胞針頭過濾器,10/pkg |
PALL | AP-4952 | 白細胞針頭過濾器,50/pkg |
QIAGEN | 52904 | QIAamp Viral RNA Mini Kit?病毒RNA提取試劑盒 |
Peprotech | BGK05231 | Human IL-6 Pre-Coated ELISA Kit |
PALL | AP-4951 | 白細胞針頭過濾器,10/pkg |
PALL | AP-4952 | 白細胞針頭過濾器,50/pkg |
QIAGEN | 52904 | QIAamp Viral RNA Mini Kit?病毒RNA提取試劑盒 |
QIAGEN | 762164 | PAXgene Blood RNA Kit |
QIAGEN | 762174 | PAXgene Blood RNA Kit (50) |
QIAGEN | 74104 | 總RNA小量提取試劑盒 |
Thermo | KIT0204 /KIT0214 | PicoPure RNA Isolation Kit |
Thermo | 15596026/15596018 | TRIZOL RNA提取試劑 |
Corning | 88-571-kit | Corning NK細胞培養(yǎng)套裝?KIT-Ⅱ |
Corning | 88-581-CM | 康寧Corning免疫細胞培養(yǎng)基 |
Corning | 88-551-CM | 康寧Corning DC/CIK?細胞無血清培養(yǎng)基 |
LONZA | 04-418Q | 免疫細胞治療無血清培養(yǎng)基 |
Mabtech | 3880-1AD-6 | 人IgG ELISA開發(fā)試劑盒(ALP) |
GeneTex | GTX36951 | IgM ELISA Kit |
Cellartis(TAKARA旗下) | Y50200 | Cellartis? MSC Xeno-Free Culture Medium(Y50200) |
華雅干細胞 | HX0201M | 人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基-HY STEMCELL |
Lifeline | LL-0062 | 骨髓MSC完全培養(yǎng)基套裝 |
Lifeline | LL-0034 | 人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基套裝 |
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